毛囊发育相关miRNA及外泌体的研究进展

王 丹, 张新玉, 贾 琪,, 张双双,, 张立春, 孙福亮*

(1.延边大学 农学院，吉林 延吉 133002；
2.吉林省农业科学院 动物生物技术所，吉林 公主岭 136100)

毛囊(hair follicle,HF)的发育是通过紧密协调的原型外胚层和中胚层相互作用进行的。毛囊是一个具有独特结构和功能的微型器官，其中，干细胞的周期性活动能够激活毛囊的再生[1-2]。外泌体(exosomes,exo)源于体内系统的胞外囊泡，占细胞外基质中囊泡的一部分，大小约为50～200 nm，是微环境中细胞间交流的重要载体，它可以调节细胞的生物学行为，如增殖、迁移[3-4]。MicroRNA (miRNA)是一种长度约20～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA。miRNAs是基因表达的关键调控因子，在动物发育、细胞增殖、分化、凋亡和代谢方面起着至关重要的作用[5-6]。该文从外泌体及miRNAs在毛囊发育中的调控机制进行综述，并对外泌体及miRNAs的主要作用进行总结，深入挖掘它们对毛囊的调控机制，为后续研究提供一定的理论参考。

1.1 毛囊结构

毛囊是一个具有独特结构和功能的微型器官，毛囊的形态发生依赖于紧密协调的外胚层-中胚层相互作用。毛囊一般分为3段：漏斗、峡部和毛囊下部。漏斗上部有干细胞群，具有再生漏斗的能力；
峡部是皮脂腺导管和隆起之间的部分；
毛囊从毛囊隆起延伸到毛囊底部，由毛胚和间充质真皮乳头(dermal papilla ,DP)组成。漏斗、峡部和突起来源于外胚层，而DP来源于中胚层。毛囊横截面显示同心上皮层，具有明显的角蛋白模式，包括外根鞘、伴随层、内根鞘和发干(图1)[1]。

图1 干细胞动物群及其在静息(休眠)成人毛囊中的个别位置示意图

1.2 毛囊周期

毛囊是一个循环的生物系统，有生长期、退行期和休止期3个阶段[7](图2)，每个阶段都有独特的基因激活和沉默模式。相对静止期的特点是许多参与控制毛发特异性角质形成细胞分化的基因沉默。从静止期到生长期形成新的毛干，并伴随着大量信号通路激活，这些信号通路控制着编码毛发特异性角蛋白、内根鞘和色素沉着基因的表达。

图2 毛囊周期性生长示意图[8]

[8]

2.1 miRNA的结构与功能

miRNA是长度约为24个核苷酸的非编码小RNA分子。miRNAs的主要功能是抑制其靶mRNA向蛋白质的翻译。它们与其靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)中的互补序列结合[9]。

现阶段的研究表明，miRNAs在机体的许多生理过程中起着关键作用。例如细胞的成熟、转化、增殖和凋亡。此外，miRNAs还参与许多病理过程的发展，如肿瘤转化、炎症过程以及慢性疾病的发展。Fründt等[10]的试验结果表明，miR-16、miR-146a、miR-221等在肝癌和肝硬化中出现特异性表达，可用于区分肿瘤患者和肝硬化患者。Jaszczuk等[11]认为，miR-210作为代表缺氧诱导的miRNA可参与阻止细胞增殖、抑制线粒体呼吸、阻止DNA修复和血管生成。在此基础上他们提出，miR-210可以作为监测先兆子痫发展过程中的生物标志物的猜想。miR-205在小鼠生长期和退行期存在显著性差异，对毛囊周期的转换有一定影响[12]。邓文佳等[13]通过毛乳头细胞(Dermal papilla cell,DPC)的体外培养提出了miR-133b可能通过抑制DPC的增殖分化，对毛囊发育起到抑制作用导致雄激素源性脱发。Cao等[14]提出神经祖细胞系衍生的外泌体模拟纳米囊泡(ReN-NV)来源的miR-100通过抑制多个Wnt负调控因子来激活Wnt信号通路，同时，增强β-catenin的核表达，从而增加了C-myc和Cyclin D1表达水平，导致毛囊的生长加速。同时经鉴定得出miR-99/100和let-7a/c是心肌细胞再生的重要调节因子[14]。Zhao等[15]发现miR-218导致兔毛的长短不一，存在显著性差异。该研究通过荧光素酶实验验证miR-218-5p与SFRP2之间的靶向关系，结果表明，miR-218-5p可调节Wnt信号通路的活性和细胞凋亡，为后续验证miR-218在调节毛囊发育中的作用提供了依据。

2.2 miRNA的调节机制

Ge等[16]的研究表明，miR-29a/b1可通过靶向CTNNB1、LRP6、BMPR1A和CCNA2来阻止毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSC)谱系的特定表达。通过建立miR-29a/b1过表达和抑制的小鼠模型，证明了miR-29a/b1抑制WNT信号、BMP信号和HFSC的细胞周期性。miR-29a/b1通过抑制基质细胞增殖可能阻止终末分化来缩短毛发生长，这些数据确认miR-29a/b1可能成为脱发的治疗靶点。最近有研究表明，miR-218-5p通过靶向SFRP2在细胞凋亡中作用，用CCK8法检测后证实了miR-218-5p mimics促进RAB-9细胞在24～72 h的增殖[15]。Du等[17]的研究表明，miR-214 inhibitors导致细胞增殖、诱导细胞分化。同时miR-214可与靶基因EZH2结合抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性，从而影响细胞周期性，对毛囊发育产生影响。Lo等[18]的研究表明，角质形成细胞释放的外泌体中含有特定的黑色素细胞的miRNAs，这些miRNAs可通过改变基因表达模式和酶的活性来调节黑色素细胞的色素沉着状态。外源性miR-21抑制剂在诱导上皮-间充质转变的条件下可抑制波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的上调[19]。Wang等[20]提出，miR-21a-5p可通过MITF途径靶向SOX5。研究表明，miR-23b可能通过靶向PTEN来抑制NLRP3炎症体的激活，从而调节NRF2信号通路，发挥抗氧化作用，抑制细胞焦下垂[21]。

2.3 miRNA对毛囊的调控机制

2.3.1 miRNA通过 Wnt/β-catenin信号通路对毛囊调控

Wnt/β-catenin信号是成体干细胞的中枢调节因子。Wnt显示基因的不同敏感性，β-catenin起粘附和信号转导的双重作用。信号由Wnt配体启动，Wnt配体与Frizzled受体和LRP5/6辅助受体相结合，导致细胞质β-catenin降解的蛋白质复合物失活[22]。Wnt配体在表皮中的过表达可以增加再生毛囊的数量，一个成熟的毛囊形成需要激活Wnt配体，启动间充质细胞-上皮细胞相互作用，同时也需要下游的的Shh信号刺激[23]。Wnt3a、Wnt5a 以及Wnt10b在生长期的皮肤组织中均可见有表达。Wnt3a在毛囊的外根鞘、内根鞘、毛母质以及毛干前体细胞中均有表达，在毛母质细胞中表现较高，在毛乳头细胞中表达较低。

Wnt5a在毛囊内分布范围较Wnt3a具有局限性，只在毛母质，毛干前体细胞和内根鞘中表达，表达较微弱。Wnt10b在人体生长期毛囊表达部位和Wnt3a相似，在内根鞘、外根鞘、毛母质细胞以及毛干前体细胞中均有明显的表达，而在毛乳头有微弱的表达[24]。最近有研究提出，miR-27a-3p可以调节Wnt3a的表达，可以就此提出猜想，miR-27a-3p可以通过调节Wnt3a的表达来调节毛囊细胞的增殖分化，这需要通过试验来验证[25]。有研究证实皮肤的Wnt/β-catenin信号是DPC成熟的必备条件。Wnt和Shh是诱导毛囊生长周期的关键途径。RNA seq表明缺失LRRK1的小鼠皮肤中Wnt和Shh的信号表达强度均出现下调，经q-PCR与免疫染色后得出LRRK1控制着一种新型LRRRK1/Wnt/Shh调控网络，为今后的脱发治疗提供了一个新方向[26]。Wu等[27]利用CCK8试剂盒证实了chi-miR-130b-3p通过靶向Wnt10a来调节上皮细胞和真皮成纤维细胞的增殖，从而达到维持毛囊结构稳定的目的。有研究表明，miR-100通过激活β-catenin通路促进了毛乳头细胞的增殖，为生发治疗提供了一种新思路[14]。

2.3.2 miRNA通过Notch信号通路对毛囊调控

Notch信号通路是细胞调控的主要途径之一，主要是两类跨膜蛋白相互作用，Notch受体和Delta和Serrate/Jagged家族配体。Powell等[28]采用Notch-1受体与Delta-1、Jagge-1、Jagge-2配体结合证实了Notch信号通路与毛囊的生长发育相关。最近有研究表明，ADAM10通过Notch信号通路在毛囊形态变化中发挥作用，利用构建Notch信号受损的小鼠模型，证实了受损的Notch信号传导是ADAM10下游炎症性脱发表型的主要途径[29]，泛酸(pantothenic aicd,PA)可用于治疗脱发,Wang等[30]利用水貂的真皮成纤维细胞和DPC研究观察到PA通过抑制Notch1的mRNA和蛋白的表达来抑制DPC的增殖，同时也验证了PA处理可抑制DPC的WISP1和Wnt11表达。有研究表明，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)对毛囊的周期调控有重要影响，可阻止生长期结束的毛囊直接进入退行期，Zhang等[31]通过用(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(C23H26F2N2O4,DAPT) 阻断Notch1信号通路证实了EGF通过Notch信号通路促进DPC的增殖，同时也证实了EGF可以通过Notch信号通路刺激DPC中MSX2的表达。在真皮乳头中，Notch1与启动子区域的RBP-JK结合促进了Wnt5a的表达，同时Notch/RBP-JK信号通路激活了Wnt5a的表达，证实了Wnt5a通过促进FOXN1基因的表达介导Notch信号转导[32]。Zhang等[33]提出，miR-31、miR-10a可调控皮肤中的Notch通路。有研究表明，这个机制在调节角质形成细胞的分化和诱导黑色素细胞向毛皮层角质形成细胞分泌黑色素方面起着重要作用[34]。Jiang 等[35]通过体外培养HFSCs证实了DAPT通过抑制Notch1信号的下游效应因子Hes1来抑制Notch信号通路，从而导致HFSC的分化被抑制。最近有研究表明，miR-10b通过靶向DVL3来调控Notch信号通路，从而影响山羊的毛色[36]。

2.3.3 miRNA通过FGFs对毛囊调控

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGFs)有23个成员，为 FGF1至FGF23，通过与成纤维生长因子受体(Fibroblast growth factor receptors,FGFR) 相结合参与动物体内多种生物学过程[7]。徐晶等[37]证实了miR-1298-5p可通过抑制其靶基因FGF2的表达来促进毛囊的生长发育，从而导致毛囊的生长周期发生变化。在FGF家族中，FGF5和FGF7分别在毛囊的外根鞘和毛乳头中表达。FGF5缺失会导致小鼠的毛发过长，FGF7缺失会导致小鼠毛发出油、毛躁[38]。Zhou等[39]提出了miR-125b可能通过靶向FGF5来调控毛发的长度，这个假设需要用进一步的试验来证实。有研究表明，FGF7能阻断毛囊诱导分化，FGF9能促进毛囊再生，FGF13的缺少会引起X染色体先天性全身多毛症[40]。有研究表明，FGF13在体内表达量减少时会导致X连锁先天性全身多毛症[41]。FGF1可以刺激形成细胞，在毛囊内根鞘细胞和其他毛囊细胞中表达。FGF18可以激活FGFR2和FGFR3，其表达部位随毛囊生长发育发生迁移，同时FGF18能通过间接调控诱导毛囊生长期生长[42]。有研究表明，FGF10在毛囊外根鞘有表达，可促进HFSCs的增殖分化，从而促进毛发生长[43]。FGF20控制毛囊发育过程中原发和继发真皮凝聚物的形成，FGF20可以调节Eda/Edar和Wnt/β-catenin信号通路，但无法调节Shh信号通路。FGF20在动物表皮中可抑制Wnt/β-catenin，但在真皮冷凝物中发挥激活它的作用，同时FGF20缺失会抑制Eda的表达，因此研究表明FGF20是形成初级毛囊和大部分次级毛囊的必备条件[44]。有研究表明,miR-100-5p通过其靶基因FGF21来调节黑色素的合成[45]。

3.1 外泌体的结构与功能

Johnstone等[46]于1987年将直径为40～100 nm的囊泡命名为“外泌体”。外泌体是细胞外的部分小囊泡，脂质双层胞外囊泡，大小约50～200 nm，由蛋白质、核酸等复杂成分组成，具有调节细胞增殖和迁移的功能[4,47]。外泌体多存在于动物体液中,如尿液、血液、乳液、唾液和精液等，也可通过T细胞、B细胞、上皮细胞、树突状细胞和肿瘤细胞等运输[46]。

Widgerow等[48]认为，外泌体能在细胞间转移生物活性分子。Keerthikumar等[49]研究发现，经外泌体包裹后的miRNAs不易降解，可进行反复冻融，提高试验的可重复性。Zhou等[50]通过小鼠腹泻建模得出牛乳中的外泌体可对肠道菌群起一定的调节作用。Schwarzenbach等[51]认为，外泌体利用细胞间的通讯来转移致癌物质。周付安等[52]运用细胞流式术证实胃癌细胞外泌体对巨噬细胞极化存在显著影响。Yamaguchi等[53]提出，角质形成细胞可能通过外泌体来运输影响黑色素细胞生理特性的细胞因子。Sun等[54]提出，血清中的外泌体可以通过促进细菌感染发生的炎症反应参与硬骨鱼的先天免疫。外泌体通过介导miR-133-3p的转移增加了半拉维埃线虫中促炎性细胞因子的表达，导致了哈维氏线虫感染时过度的炎症反应，为中国人舌根皮肤溃疡的治疗提供了新的治疗思路[54]。现有研究表明，脂肪来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)外泌体与骨髓来源的MSCs外泌体相比，更显著地改善了肾脏的功能和结构，脂肪来源的MSCs外泌体通过抑制氧化应激和炎症来保护脂多糖诱导的急性肾损伤[55]。

3.2 外泌体对毛囊的调控机制

有研究表明，外泌体能通过旁分泌机制在对毛囊的生长起关键作用，这为治疗脱发提供了新的研究思路[56]。Zhou等[57]在毛囊不同周期阶段将DPC衍生的外泌体(DPC-Exos)皮下注射到毛囊中，运用组织学和免疫组化分析证明了DPC-Exos能刺激调节毛囊中的β-catenin和SHH的表达。DPC-Exos在体外可促进外根鞘细胞(outer root sheath cells,ORSCs)的增殖和迁移，调控毛囊的生长并维持生长期、改变毛发周期，为脱发治疗提供了一种可实施的途径。Yan等[58]更进一步说明了DPC-Exos是通过刺激β-catenin的表达，进一步来调节毛囊的生长发育。但是对于DPC-Exos调控毛囊干细胞(HFSC)行为的机制还不完全清楚，需要接下来做更深层次的研究。

Carrasco等[59]提出了一个新型观点，经数据分析后发现外泌体有望用于治疗自身免疫性疾病，可作为传递有HFs的免疫特权的信号分子的载体。同时也为自身免疫所导致的脱发治疗提供了一个新的方向。Ogawa等[60]提出，外泌体的存在是角质形成细胞与HFSC相互作用的分子基础，通过试验表明，非瑟酮在对角质形成细胞产生作用的同时，引起了外泌体的分泌，从而激活了HFSC，证明了角质形成细胞来源的外泌体可以激活HFSCs，从而诱导毛发生长。Nilforoushzadeh等[61]通过荧光定量发现，外泌体可以自由进入到DPC中,同时外泌体已被证明可以促进伤口愈合，有效地防止瘢痕形成，诱导毛发生长。曹丹霞[62]通过用添加外泌体的完全培养液对DPC进行培养，发现，DPC的增殖活性增强，同时显著改善了DPC随代数增长其细胞活性下降的问题。陈宇新[63]发现，DP-Exo可以促进部分损伤的毛囊再生，同时可以通过下调Wnt5a、BMP2和BMP4的表达，从而促进毛囊再生以及由休止期向生长期的转换。通过构建潜在靶基因的PII网络，提出miR-328-3p、miR-423-3p和miR-143-5p等可能在DP-Exo调控的毛囊再生和生长周期转换中起到重要作用。Kwack等[64]提出，来自DPC的Exos通过调节毛囊真皮和表皮细胞的活性可以达到促进毛发生长和毛发再生的目的，这对脱发治疗具有重大意义。

随着对毛囊研究的逐渐深入，需了解到越来越多的调控毛囊增殖和分化的途径，这有助于进一步对基因表达调控网络进行探索。miRNAs对毛囊的调控作用及调控方式需更进一步去探索。同时对于外泌体的研究也更进一步地推动了miRNAs与其靶基因调控研究的发展，是通过信号通路调节还是细胞因子调节仍有待深入研究。探明外泌体与miRNAs的关系、miRNAs与其靶基因的关系和miRNAs调控毛囊周期发育的路径,可为毛用动物创造更大的经济价值，同时在临床上也为脱发提供一个治疗的新思路。其中对于外泌体来源的miRNAs对毛囊生长发育调控的相关研究很少，有待于进一步研究。关于外泌体来源的miRNAs调控毛囊生长发育，这方面的研究还不够深入，要想得到完整的调节机制，仍需要不断探究。

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