控藻剂对丝状藻类的药效评价方法研究进展

翁爱珍，陈俊鹏，陈润丽，杨婷婷，张有根，徐宗余，黄小威

（宁波三江益农化学有限公司，浙江 宁波 315000）

随着工农业的迅速发展和城镇化进程的不断加快，人类活动对水生生态系统的影响日益加重。藻类是自然水体中的初级生产者，对水体生物多样性及渔业生产起重要作用，但部分水体交替更新周期长、自净能力差，以及人类影响、气候变化等多种因素使水体内氮、磷等营养物质富集，藻类过量繁殖[1-3]。过度生长繁殖的丝状绿藻会阻碍水道交通，降低湖泊的娱乐、美学和商业价值[4-7]，平铺于沉积物之上形成很厚的丝状绿藻藻垫，消耗大量的营养物质和氧气，严重影响底栖生物群落[8]。随着气温、水温的升高，丝状绿藻类进入衰亡期开始腐烂变质大量死亡，散发一种恶臭味，腐烂的藻体不仅分泌有害物质，还会致使水底厌氧，透明度显著下降，生物多样性指数降低，水质恶化，生态失衡，给沉水植物恢复及湖泊管理带了很大困难[9-13]。

当前控制藻类爆发的方法主要包括物理法、生物法和化学法。化学法是目前全球使用较多、范围较广的控藻方法，具有速度快，不易复发，范围广，可控制等优点，是目前小型池塘、湖泊以及养殖基地等一定区域内最常用的应急控藻措施[14]。化学法中使用控藻剂来控制藻华或藻类种群过度增长是一种常见且相对经济的方法。化学控藻剂种类很多，大致可分为金属离子控藻剂、光敏物质控藻剂、除草剂以及一些天然化学试剂（化感物质）等，其中铜基控藻剂最为常见[15,16]。较低剂量的控藻剂可以减轻对生态系统的影响，降低沉积物中铜负荷和铜沉淀的风险，节省时间和金钱，但过低的剂量很难达到预期的防治效果[17,18]。因此，寻找对藻类高效、对非靶标生物低风险的控藻剂是控制周期性发生藻华的关键问题。

目前市场上各种化学控藻剂面临使用方式不明确、效果良莠不齐、施用量没有明确范围等突出问题。一般来说，控藻剂的施用量也应与目标使用地点的水体藻含量有关[19]，控藻剂的使用还要注意其使用目的。使用方法和施用剂量应根据使用目的、藻的种类、藻类的发生情况、藻类所处环境、水质情况、水深等多种因素来定。关于控藻剂的研究结果大多是单一针对某一方面的实验结果，没有相同的对比。在实际应用中，由于各方面原因，化学控藻剂的选择比较困难，用量也模糊不清。通过标准化的实验测试，评估不同控藻剂实际应用效果势在必行。

本文通过综述防控水体丝状藻类的药效评价方法，可为水产养殖、农业种养殖、环保部门和科研试验单位制定室内和野外药效试验方法准则及相关标准提供参考依据。

水体中常见的丝状藻类包括绿藻门的水绵属Spirogyra、双星藻属Zygnema、转板藻属Mougeotia、水网藻属Hydrodictyon、刚毛藻属Cladophora、毛枝藻属Stigeoclonium、鞘藻属Oedocladium、浒苔属Enteromorpha；
蓝藻门的席藻属Phormidium、鞘丝藻属Lyngbya；
黄藻门的黄丝藻属Tribonema[20]。研究发现，不管是用于观赏的水体池塘[21,22]、渔业水体[23-25]，还是海洋水体中[26]都出现了丝状藻藻华泛滥的现象，产生的不良影响日渐严重。关于控制丝状藻药物的研究较少，例如虾稻田水绵的防控一般局限于个别药物的研究，如硫酸铜[27,28]，大量药物的筛选研究鲜见报道，因此，关于药物筛选的方法与模型，没有统一规范的标准。在丝状藻研究中对药剂防效的评价方法不尽相同，主要包括覆盖面积评价法、生物量评价法、叶绿素a 含量评价法以及叶绿素a 总量评价法。

1.1 覆盖面积评价法

丝状藻类防效评估中，表面覆盖度是运用最为广的防效评价手段。该法可以直观看到药剂对藻类的作用效果，可通过藻类颜色失绿黄化、沉降以及降解等生长状况评价防效。覆盖度根据田间水绵发生程度（覆盖度薄厚、点片、连片、成网及清晰度等）分为0～9 级[29]：0 级（无水绵）；
1 级（覆盖面积1%～10%，稍有水绵）；
3 级（覆盖面积11%～25%，水绵轻微发绿）；
5 级（覆盖面积26%～50%，视野可见水绵）；
7 级（覆盖面积51%～75%，水绵结网）；
9 级（覆盖面积76%～100%，水绵遍布）[30,31]。根据级数计算覆盖度防效，如公式（1）所示。

刘桂英等[30]通过覆盖面积评价法对45%苯乙锡·锰锌、20%乙酸铜可湿性粉剂和熟石灰等7 种药剂的防效进行评价；
其中西草净采用毒土法施药，熟石灰直接撒施，其他药剂均使用喷雾法施药防治稻田水绵的试验。在施药3～40 d 内调查药效5 次，通过目测覆盖度得出防效，结果显示处理40 d 后45%三苯基乙酸锡、46%苯乙锡·硫酸铜、96%硫酸铜和25%西草净药效仍保持在94%以上。这4 种药剂不仅药效持久稳定，且对水稻安全。杨微等[31]也使用此法评价药剂防效，采用毒土法施用15%西草净可湿性粉剂和80%苯噻酰草胺-吡嘧磺隆-西草净水分散粒剂来防治水稻田水绵。根据目测水绵发生危害程度用覆盖面积估计来进行防效评价，结果显示水绵覆盖面积小于25%时，西草净或80%苯噻酰草胺·吡嘧磺隆·西草净均可防治；
水绵覆盖面积大于25%时，施用一定剂量的西草净，既可有效控制水绵又对水稻安全。使用不同方法和施用不同药剂防治移栽水稻田、荷塘等地中的水绵，同样采用覆盖面积法评价药剂防治效果[29,32,33]。Welch 等[34]在研究腐烂的大麦秸秆是否能降低运河丝状藻类的生长试验时也曾采用目测法，只是评估了丝状藻类的覆盖度和生长，但没有使用分级，结果显示秸秆上下段藻类生长量在视觉上没有明显差异。

覆盖面积评价法适用于室外环境下药效的评估，可以直观看到药剂的效果，估计方法快速、简单，可以大大减少工作量，但对于水下藻类的死亡情况无法评价。该方法评价方式较粗糙，分级结果受个体目测差异影响较大。

覆盖度防效公式如下：

式中：E—抑制率，%；
CK—对照的目标藻类平均级数；
Dt—处理的目标藻类平均级数。

1.2 生物量评价法

根据农药田间药效试验准则（一）除草剂防治水稻田杂草中杂草的调查方法，根据丝状藻类本身生长特性，无法使用株数进行调查，因此选用生物量法（鲜/干重）和覆盖面积法作为评价指标，其中生物量法满足该标准中绝对值调查法和估计值调查法，适用范围更广。鲜/干重法具体操作过程：每瓶放置鲜重相等的丝状藻，药剂处理后将剩余的丝状藻用尼龙布过滤，再进行脱水称得鲜重，最后置于105℃烘箱内烘干至恒重后称得干重，最后根据公式（2）计算其防效。

韩军等[29]研究25%西草净可湿性粉剂和20%苯乙锡·铜可湿性粉剂对移栽水稻田水绵的防效，用鲜重差异评价防效。Shao 等[35]在实验室条件下采用鲜重作为评价丝状藻类生长指标发现，银杏和柳叶提取物对丝状藻Cladophora sp.的生长有抑制作用，水杉对藻类生长有轻微的促进作用。高伟等[14]以干重评价抑藻率，研究了9 种控藻剂及3 种复配控藻剂室内培养条件下对水绵生长的影响。结果表明，9 种控藻剂对水绵的抑制作用均较差，复配10 mg/L 二氧化氯-敌草隆有一定的抑制效果，抑制率达到51%。Hallingse 和Phlips[36]在实验室条件下研究三乙醇胺螯合铜Cutrine-Plus 和表面活性剂Cide-Kick Ⅱ对丝状绿藻Spirogyra communice 和丝状蓝藻Oscillatoria sp.和Lyngbya wollei 的活性影响，5 d 后用干重评价药物的EC50，发现添加表面活性剂并没有提高三乙醇胺螯合铜对丝状藻类的抑制活性。Murray-Gulde 等[19]用干重作为指标之一研究了三种含铜控藻剂Clearigate、Cutrine-Plus 和硫酸铜对浮游淡水绿藻的杀灭活性，96 h 内能控制半数藻类的浓度EC50显示，硫酸铜、Cutrine-Plus 和Clearigate 对每mg 藻类干重的铜负荷量分别为4.2 μg、7.3 μg 和7.9 μg，EC50由小至大依次是：硫酸铜、Clearigate、Cutrine-Plus。Prazukin 等[37]根据丝状绿藻在湖泊中区域的不同，使用干湿重评估生物量体积质量浓度。Webb 等[38]研究猪场厌氧消化废液中丝状藻的相关指标时采用生物量评价藻产率。戴晨明等[39]在研究光强及氮浓度对丝状绿藻双星藻Zygnema生长及生化组成的影响中，也采用生物量作为评价指标，衡量不同因素对丝状藻生长的影响。Lu[40]等通过丝状藻的鲜重差异，评价丝状藻受到不同外因干扰后，生物量的变化。用生物量法评价藻类生长抑制效果的例子较多[41-44]。

生物量法易于操作，可以评价不同药剂在单位时间内抑制对藻生长。但不同药剂的致死机理不同，有些药剂杀死藻类后藻体并不分解，有些药剂无法杀死藻类但可以抑制其生长，生物量法无法将两类药剂的差异区分开。

鲜/干重防效的计算公式如下：

式中：E—抑制率，%；
CK—对照的目标藻类鲜/干重，g；
Pt—处理的目标藻类鲜/干重，g。

1.3 叶绿素a 含量评价法

叶绿素a 是反映浮游植物生物量乃至水体富营养化程度的最直接有效的指标之一[45]。叶绿素是藻类的主要光合色素，常见的是叶绿素a，其含量大约是藻干重的1%～2%，是藻类生物量的重要指标[46]。目前，一般多采用分光光度法测定叶绿素含量[47]。叶绿素提取采用热乙醇分光光度法[48]测量丝状藻类的叶绿素a 含量。方法如下：取样后放入10 mL离心管，加入95%乙醇，超声波破碎，离心，取上清液，用95%乙醇定容至10 mL，在波长664 nm、649 nm 下测定吸光度，以95%乙醇为空白对照，计算叶绿素a 含量和防效[57]，如公式（3）和公式（4）。

大多数研究者采用叶绿素a 含量作为控藻剂对丝状藻类的防效评价指标。廖金花[50]在室内条件下研究了不同浓度的扑草净对水绵的毒性效应，处理后96 h 测定水绵的叶绿素a 含量以评价药剂对水绵的防效，结果显示≤10 mg/L 低浓度扑草净对水绵生长有促进作用，≥30mg/L 高浓度扑草净对水绵生长具有抑制作用。高伟[14]在室内条件下采用热乙醇法测定叶绿素a 含量，以评价控藻剂对水绵的防效。早在1983 年，O’Neal 和Lemni 研究了除草剂西玛津Simazine 对丝状藻水绵Spirogyra jurgensii（Kutz）、Pitbopbora oedogonia（Mont.）和Cladophora glomerata（L.）Kutz 生长的影响，叶绿素a 含量的变化被当作藻类对除草剂的反应指标。结果表明，在光照强度为100 μE·m-2·s-1及以下时，藻类暴露在5 μM西玛津下生长受到显著的抑制；
光照强度为400 μE·m-2·s-1时对水绵的杀灭效果最明显[51]。后来Gibson 和Welch 都在实验室培养中研究了大麦秸秆对丝状藻类的生长抑制作用，使用叶绿素a 含量作为评价指标，结果表明腐烂的大麦秸秆可以降低丝状藻类的生长速率和明显减少丝状藻类的叶绿素a 含量[34,52]。Murray-Gulde 等[19]探究三种含铜控藻剂对淡水绿藻的控藻效果，采用叶绿素a 含量作为测定控藻剂有效性的响应参数，结果显示3 天后的EC100由小至大依次分别是CuSO4、Cutrine-Plus和Clearigate。Wersal 等[53]使用螯合铜控藻剂F-30对一般丝状和浮游藻华进行控效试验，通过7 d、14 d、21 d 和28 d 后的叶绿素a 含量作为评价藻类生长的指标，实验结果表明螯合铜控藻剂可以有效控制藻类的生长。Bishop 等[54]研究铜基控藻剂CaptainXTR、Cutrine Ultra 和硫酸铜配方对两种常见丝状藻类Lyngbya wollei 和Pithophora varia 的控制效果差异，以叶绿素a 含量作为测定指标之一，CaptainXTR 基于叶绿素a 含量所得结果显示其对Lyngbya wollei 7 天的EC85为0.78 mg Cu/g，效率最高的是CaptainXTR，其次是Cutrine Ultra 和硫酸铜。对丝状藻类研究中，用叶绿素a 含量作为藻类参数评价的案例较多[55-61]。

叶绿素a 含量是一个相对敏感的参数，用其作为评价法灵敏度高，准确性高，适用范围广，通过测定室内外试验藻类叶绿素a 含量，可以准确评价破坏细胞光合作用的控藻剂。但对筛选仅抑制藻类生长而不破坏细胞叶绿素的控藻剂来讲，该法存在一定的局限性。

叶绿素a 含量的计算公式如下：

式中：Ca—藻类叶绿素a 含量，mg/g；
A664nm—乙醇萃取液在波长664 处的吸光值；
A649nm—乙醇萃取液在波长649 处的吸光值；
V—提取液体积，L；
W—样品鲜重，g。

式中：E—抑制率，%；
Ca1—对照的叶绿素a 含量；
Ca2—处理的叶绿素a 含量。

1.4 叶绿素a 总量评价法

当试验中药物及浓度梯度数据较多且各药物作用机理不同，为综合评价药物的作用，藻类抑制效果采用试验结束时叶绿素a 总量来评价。具体操作过程：先用纱布过滤处理后的藻类，离心脱水后称重（同生物量法）；
再测定叶绿素a 的含量（同叶绿素a 含量法）；
最后根据公式（5）和公式（6）计算防效。魏朝辉等[62]在室内条件下研究了工业杀菌灭藻剂、农用除草剂、中草药杀菌剂、植物生长调节剂、水生沉水植物浸提液总共36 种药物对河蟹养殖池塘中青苔的抑杀作用，处理6 天后采用叶绿素a 总量法定量研究了综合评价青苔抑制率。郑串[63]使用过氧乙酸和异噻唑啉酮对黄丝藻进行室内外抑制实验，室内试验采用叶绿素a 总量来评价对黄丝藻的抑制效果。该实验结果表明过氧乙酸和异噻唑啉酮配合施用对黄丝藻的防效可达94%以上，其中过氧乙酸和异噻唑啉酮配伍浓度1.00∶0.60 mg/L为最适比例。国内使用该方法评价药效的较少，国外暂时没有相关报导。

相对于其他方法来讲，叶绿素a 总量法测定步骤繁琐，但该方法综合了生物量法和叶绿素a 含量法的优点，弥补了两种方法中的缺陷。该方法尤其适用于药物和筛选浓度数据多、各药物作用机理不同、丝状藻类表现特征不同的情况，可以区分不同作用机理的控藻剂，从而综合评价药效。

式中：G—叶绿素a 总量，mg；
M—藻类重量，g；
Ca—藻类叶绿素a 含量，mg/g。

式中：E—抑制率，%；
G0—空白对照组叶绿素a总量，mg；
Gt—药物处理组叶绿素a 总量，mg。

2.1 丝状藻类评价方法的综合性

对水绵的研究可以发现，大部分研究是使用两种或多种评价方法综合评价药效。如高伟[14]通过水绵的干重和叶绿素a 含量评价抑藻率，叶绿素a 含量与干重的变化情况保持一致。韩军等[29]、孙福华等[41]和朱文达等[44]用水绵覆盖度和鲜重来评价药剂对水绵的防效，两种评价方法所得结果一致。李文玲等[33]通过覆盖度防效和叶绿素含量变化综合评价药剂对水绵的防效，覆盖度防效结果与叶绿素含量变化结果相吻合。Zhang 等[60]使用叶绿素a 含量测定附着藻类的含量，以湿重作为大型漂浮藻垫子的生物量评价指标。Webb 等[38]研究猪舍废水中的丝状绿藻时也使用生物量和叶绿素a 含量进行评价。综合采用几种不同的评价手段评价药效，更能明确药剂的防治效果。

2.2 丝状藻类药效评价方法的选择性

不同药物作用机理大型丝状藻类表现特征均不同，需要有选择性地采用适当的评价方法，得到更准确地试验结果。如青苔净防治青苔的作用机理直接与叶绿素a 含量相关。这类药剂与水绵细胞直接接触，透过细胞壁和细胞膜进入细胞内破坏其细胞质和细胞核，导致细胞变异和破损，干扰叶绿素的合成，抑制其光合作用和呼吸作用，使其死亡[64,65]，通过叶绿素含量的变化也可以判断药剂对青苔的抑制作用[33]。有些药物如扑草净对叶绿素a 含量影响不大，却能控制青苔生物量的增加，抑制青苔生长，杀灭作用不强[63]。这类药剂对青苔的抑制作用可以通过青苔生物量的变化来衡量。当一种药剂无法判断其作用机理时，可选择采用叶绿素a 总量法进行综合评估。

2.3 丝状藻类药效评价方法的局限性

室内的评价方法与田间的药效评价方法不完全通用，应根据室内外试验对象藻类的特性和应用场景选择合适的评价方法。使用生物量对丝状藻类的生长速率、增长率、产藻率、生长抑制率等参数进行评价，所使用的处理方法不尽相同。鲜重的脱水方法包括用吸水毛巾干燥、滤纸、旋转干燥机、循环水真空泵、过滤器抽干甚至自然风干等。这些方法需要根据所研究丝状藻种类、场所等因素综合考虑后，选择最合适的脱水方法。而干重的处理方法，500℃烘干5 h、90℃烘干24 h、105℃烘干至恒重等干燥方法，根据藻类性质，在一定温度下烘干至恒重的误差较小。叶绿素a 含量法中样品的处理方法不同，所使用的计算方法也截然不同。在不同溶剂下，每种藻类有相应的计算方程。本研究中的评价方式及其计算公式仅针对丝状绿藻在95%乙醇提取下的叶绿素a 含量。室内活性试验的特点为藻体体积小，可操作性强，可以使用生物量、叶绿素a 含量、叶绿素a 总量法进行评价，但覆盖面积评价法不适用。田间药效试验处理面积广、分布范围不均，环境因素影响大，可用覆盖面积法，操作简单，数据易得。

准则中NY/T1155-11[66]中已有关于除草剂防治水稻田水绵的室内活性测定试验方法，室内试验药效主要是根据叶绿素a 含量进行评价。GB/T17980.40-2000[67]准则涵盖除草剂对水稻田杂草防除的田间药效评价，但是，水绵的生长状态与杂草不同，单纯以表面覆盖度或生物量来评价不够准确。虽然目前已有多种评价方法应用于实践，但每一种评价方法都存在一定的限制条件或因素，在评价控藻剂药效的过程中，应充分考虑药剂的作用机理、使用范围等因素，选择合适的评价方法或选择几种评价方法结合的方式综合评估控藻剂药效，以期推进控藻剂产品注册，为农业有害藻管理和科研工作提供更加可靠的数据支撑。

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