基于耳石微化学特征甄别黑鲷放流群体和野生群体的初步研究

张 翼，张 辉，姜亚洲，凌建忠，刘尊雷，李圣法

(中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090)

增殖放流苗种标记是研究放流对象生长、洄游、增殖放流功效评估的重要手段[1]。国内外常见的标记方法包括挂牌标志、剪鳍法、微卫星标记、耳石元素标记等[2-4]。有效区分野生鱼种和养殖鱼种是增殖放流评估的重要内容，鱼类耳石常被用于该项研究工作。耳石是一种典型的生命矿物载体，主要由碳酸钙及一些微量元素组成，且具有特定的耳石微结构[5]。有学者基于耳石微结构的研究方法对野生鱼种和养殖鱼种进行了区分[6-7]。随着技术的进步，耳石微化学方法也常被用于鉴别野生鱼种和养殖鱼种[8-9]。在苗种的培育过程中，水温、盐度、饵料等外部条件可能会在鱼类耳石上形成特殊印记，这种印记可用于识别养殖鱼种和野生鱼种。例如，宋昭彬和曹文宣[10]利用水温可能导致的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)与鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)仔鱼耳石中心核的大小差异特征，有效区分了野生群体和养殖群体；
受饵料来源和鱼体生长率差异的影响，13C成为识别野生西大西洋笛鲷(Lutjanuscampechanus)和养殖西大西洋笛鲷的关键元素[11]。在育苗过程中，所采取的日常管理措施可能在鱼类耳石上产生特殊的“印迹”，从而形成耳石标志。

黑鲷(Sparusmacrocephalus)是一种广泛分布于我国沿海的岛礁性鱼类，也是一种重要的增殖放流对象。对于黑鲷这种放流规模大、范围广、周期长的鱼种，常规的标记方法往往费时费力。研建一种适合黑鲷的、易推广、低成本的标记方法成为有效推进黑鲷增殖放流评估工作的关键。黑鲷耳石元素标记成功的3个可行性条件：1)鱼耳石中锶Sr和钡Ba元素主要来源于鱼类生活的水体[17]；
2)淡水Ba浓度一般高于海水[13-14]，海水Sr浓度显著高于淡水[15-16]；
3)黑鲷育苗的适宜盐度为18～25[12]。我国近岸海水盐度约为30～33。据此，在黑鲷的育苗过程中，向天然海水种添加淡水降低盐度后，形成养殖海水，这种养殖海水的Sr、Ba元素可能与天然海水有显著差异，从而可能在耳石上形成特殊的微化学标志。

本研究以黑鲷为研究对象，通过开展基于耳石微化学分析的实验，分析养殖黑鲷幼鱼与野生黑鲷幼鱼的耳石微化学特征，探究了基于日常管理措施的养殖黑鲷耳石元素标记方法的可行性，同时对黑鲷成鱼进行耳石元素标志识别的验证，以期为利用该项技术开展黑鲷增殖放流标记提供依据。

1.1 材料采集及样品处理

2019年5—6月，在象山港开展黑鲷增殖放流活动前，利用流刺网采集黑鲷幼鱼样品，并记录采样站位的水温、盐度。采集到的黑鲷体长3.05～3.89 cm，样本量20尾。根据采样时间和体长判定所采集到的这些样品为野生黑鲷幼鱼。同年6月，在宁波市象山港水产引种育种有限公司采集养殖黑鲷幼鱼，体长1.96～3.61 cm，样本量30尾。在黑鲷的育苗过程中，每天向天然海水中添加淡水(自来水)来调节养殖海水盐度，将养殖海水的盐度保持在育苗的适宜盐度18～25[12]，持续时间至少30 d。记录象山港天然海水和养殖海水的盐度。随机采集5 d的天然海水、淡水和养殖海水的样品，经微孔滤膜(孔径0.45 μm)过滤去除杂质后，用塑料瓶收集保存，带回实验室检测Sr、Ba元素浓度。2020年8月，在象山港采集黑鲷成鱼样品，体长10.6～19.5 cm，样本量为20尾。

黑鲷样品经冰鲜冷藏带回实验室分析。去除耳石表面的杂质，用超纯水清洗3 min。将清洗好的耳石放入准备好的塑料模具中，使用环氧树脂包埋，室温下放置24 h待其凝固、硬化。耳石固定后，用600目砂纸在研磨机上研磨，再使用1 000目、1 500目砂纸手工打磨，最后用3 μm 的碳化硅抛光纸抛光，直至在光学显微镜下观察到耳石原基出现，制成厚度约为0.5 mm的薄片。

1.2 耳石元素分析

采用激光烧蚀联动的电感耦合等离子质谱仪(LA-ICP-MS)对耳石样本进行元素分析。利用NewWave213激光剥蚀系统对耳石样品进行线扫描和打点剥蚀后，经氦气作载气、氩气作辅助气，通过Thermo X Series II ICP-MS进行微量元素测定。激光剥蚀的波长为213 nm，剥蚀孔径为32 μm，剥蚀深度为20 μm，激光移动速度为2μm·s-1。在无任何样品的条件下，对氩气和氦气混合气体进行LA-ICP-MS 测试, 重复10次，3倍空白标准偏差所对应的浓度即为各元素的检出限。数据分析时采用氦气和氩气的混合气体作为空白对照，采用碳酸盐标准物MACS-3对耳石元素含量进行定量分析。

耳石元素分析方法包括耳石核心处元素分析和从核心向边缘线扫描元素分析(图1)。分析的指示微量元素有Sr、Ba两种。耳石核心处元素检测的位置设定为耳石原基处附近，检测方法为多点剥蚀，剥蚀的时间设置为60 s。线扫描分析的方法为从耳石核心沿着最长轴向边缘直线剥蚀检测。经滤膜过滤的天然海水、养殖海水、淡水交由北京科荟测试技术有限公司检测。

图1 黑鲷耳石核心打点样及线扫描示意图

1.3 数据分析

实验完成后将数据导入到ICP-MS DataCal软件中，数据分析时, 先根据各元素的最低检测限(lowest detection limit)等指标评价元素测定值的有效性, 去除无效元素, 只对在所有耳石个体中均被检测出的有效元素做数据分析。计算耳石样本从核心至耳石边缘的Sr/Ca、Ba/Ca比值(摩尔比)；

依据上述检测数据计算：

1)计算耳石核心Sr/Ca、Ba/Ca比值(C)；

3)引入变异系数[18](CVI)评价耳石核心至边缘的微量元素的波动变化特征。

2.1 黑鲷养殖水体锶钡元素分析

2019年5—6月，象山港天然海水盐度为25～27，表层水温18～22℃。黑鲷育苗适宜的盐度为23～24，注入淡水后，养殖海水盐度低于天然海水约2。象山港天然海水和养殖海水Sr离子浓度分别为(5 428.67±72.93)、(4 377.59±52.85)μg·L-1；
Ba离子浓度(27.33±1.39)、(41.97±1.62)μg·L-1；
Ca离子浓度(342.60±2.57)、(289.20±2.78)mg·L-1(表1)。天然海水和养殖海水的Sr/Ca比值分别为(7.20±0.09)、(6.96±0.08)mmol·mol-1，Ba/Ca比值分别为(23.3±1.2)、(42.3±1.6)μmol·mol-1。养殖海水的Sr/Ca比值、Ba/Ca比值约为天然海水的0.96、1.82倍。养殖海水Ba离子浓度显著高于天然海水(P<0.05)。

表1 天然海水、养殖海水和淡水锶钡元素分析

2.2 黑鲷耳石元素线定量分析

从耳石核心到边缘方向对养殖黑鲷和野生黑鲷耳石的Sr/Ca、Ba/Ca比值进行测定，如图2所示，养殖黑鲷和野生黑鲷耳石中Sr/Ca比值为1.5～2.0 mmol·mol-1，且Sr/Ca比值波动较小。养殖黑鲷耳石Ba/Ca比值为10～25 μmol·mol-1，野生黑鲷耳石Ba/Ca比值为3～8 μmol·mol-1；
养殖黑鲷耳石中的Ba/Ca比波动明显，野生黑鲷耳石Ba/Ca比波动相对较小。分析结果表明，养殖黑鲷和野生黑鲷耳石Sr/Ca比值无明显差异，但养殖黑鲷耳石中的Ba/Ca比值明显高于野生黑鲷。养殖黑鲷耳石半径长约为400 μm。

图2 养殖与野生黑鲷耳石的Sr/Ca、Ba/Ca比

2.3 耳石微量元素特征分析

表2 养殖黑鲷和野生黑鲷耳石核心、全耳石的Sr/Ca、Ba/Ca比值及其变异系数分析

养殖黑鲷和野生黑鲷耳石Sr/Ca比值变异系数(CVISr/Ca)分别为0.14±0.01、0.13±0.01，两者无显著差异(P>0.05)；
养殖黑鲷和野生黑鲷耳石Ba/Ca比值元素变异系数(CVIBa/Ca)分别为1.26±0.3、0.69±0.15，养殖黑鲷Ba/Ca比值变异系数(CVIBa/Ca)明显高于野生黑鲷(P<0.05)。

2.4 基于耳石Ba元素的象山港放流黑鲷判定

图3 养殖与野生黑鲷耳石核心至边缘Ba/Ca比值

3.1 放流黑鲷耳石Ba元素识别的可行性分析

水环境因子可能对鱼类耳石上Ba的沉积有影响。有研究表明，温度对大底鳉(Fundulusgrandis)、金赤鲷(Pagrusauratus)的耳石Ba的富集无显著影响[22-23]；
盐度对耳石Ba的富集影响研究有不同的结论[24-26]。本研究中,通过向天然海水中添加淡水来降低养殖海水的盐度，但盐度变化仅为3～4，根据黎雨轩等[27]、VRIES等[28]的研究可以推测，在轻微的盐度变化下，耳石上Ba的富集效应变化不大。此外，鱼体个体发育的生理作用也可能会影响耳石上Ba的富集，但由于本研究所分析的两个黑鲷群体的耳石位置是相同的，同为0～400 μm区段，即两个黑鲷群体所对应的发育阶段也是相同的，因此，个体发育的生理作用对两个黑鲷群体耳石上所产生的Ba/Ca比值差异没有直接影响。综上，本研究中温度、盐度和生理作用对耳石Ba/Ca比值的影响应该是次要的，形成养殖黑鲷耳石高Ba/Ca比值标志的主要原因是养殖海水的高Ba离子浓度。

本研究中，养殖海水的Ba浓度约为天然海水的1.82倍，而养殖黑鲷耳石的Ba/Ca比值约为野生群体的4倍，可推测养殖黑鲷耳石上Ba的沉积存在富集作用。发生Ba富集的可能原因有：1)盐度与耳石上的Ba富集能力可能呈负相关关系[29]；
2)水温与耳石上的Ba富集能力可能呈正相关关系[30]。为了深入研究耳石上Ba的沉积作用，需要对海水中Ba浓度与耳石Ba/Ca比值的定量分析做进一步研究。

3.2 放流黑鲷耳石Sr元素识别的可行性分析

3.3 利用耳石Ba/Ca比值标志识别放流黑鲷

对象山港捕捞到的黑鲷样品进行Ba/Ca比值时间序列分析，依照上述的判别方法成功识别了放流黑鲷。这两尾放流黑鲷，其耳石在0～400 μm位置内，Ba/Ca比值显著高于野生黑鲷，而在400 μm往后的位置，其Ba/Ca比值与野生黑鲷重叠(图3)。400 μm耳石径长所对应的黑鲷体长与规模化放流黑鲷的体长吻合，这一点也进一步证明了耳石上高Ba/Ca比值能够成为放流黑鲷判别标志的可行性。多个研究结果同样表明，养殖鱼种和野生鱼种耳石上的Ba/Ca比值存在显著差异[33-34]。耳石激光剥蚀元素指纹分析在鱼类来源识别的研究中具有样品制备简单、可多元素分析等优势[35]。本研究仅对Sr、Ba元素进行了分析，有学者利用多元素线性判别分析方法对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[33]等鱼类进行分析，也能有效识别野生群体和养殖群体。此外，13C、18O同位素可提高耳石元素识别分析的准确率[35-36]。为了进一步提高放流黑鲷的识别可靠性，以后可引入更多的元素进行辅助分析。

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