大麦苗期耐盐种质鉴定与评价指标筛选

霍庆平，李建波,3，门秀丽，范宏博，刘志萍，巴 图，徐寿军

（1.内蒙古民族大学农学院，内蒙古 通辽 028043；
2.内蒙古自治区饲用作物工程中心，内蒙古 通辽 028043；
3.国家民委科尔沁沙地生态农业重点实验室，内蒙古 通辽 028043；
4.内蒙古自治区农牧业科学院作物育种与栽培研究所，呼和浩特 010000）

当前，土壤盐碱化已经成为一个全球性的问题，全球6%以上的陆地面积、20%的耕地以及50%的农田均存在不同程度的盐碱化[1]。我国约有盐渍化土地3.60×107hm2，约占全国可利用土地面积的4.88%，盐渍化耕地约占全国可耕地面积的7%[2]。内蒙古自治区作为我国北方重要的生态屏障，现有盐碱化耕地1.06×106hm2，占全区总耕地面积的11.4%，耕地盐碱化成为影响当地农业生产、生态环境和经济社会发展的突出问题。由于人类活动、气候变化和季节变化等因素，土壤盐碱化仍在不断增加。由于大多数农作物易受盐碱胁迫的影响，盐碱化可能会加剧世界粮食的供需矛盾，对粮食安全构成潜在威胁[3-4]。研究表明，盐分通过增加土壤渗透势阻碍植物获得土壤水分来降低作物产量，从而抑制植物根系对水分和养分吸收，导致植物中的离子不均衡并发生离子毒性[4-5]。与其他生长阶段相比，作物在发芽和苗期发育阶段更容易受到盐分的影响[6]。目前，还没有切实可行的方案来解决农田盐渍化问题，开发能够抵御盐碱胁迫的作物品种是一个长期有效的途径[7]。

大麦是世界第四大禾谷类作物，能够在各种环境条件下生存，包括极端纬度和海拔，是最耐寒的谷类作物之一[8-9]。大麦因其可以通过在叶片中积累高Na+而在盐碱条件下存活，使其成为一种备受关注的作物[10]。例如，耐盐大麦品种Numar和ZUG293表现出盐生植物特征，与盐敏感品种Gairner和ZUG403相比，耐盐大麦可以将Na+排除在根系吸收之外[11-12]。因此，育种家利用大麦作为有利等位基因的来源，通过常规或分子方法改良其他谷物作物[13]。与其他植物物种类似，大麦的耐盐性因会随基因型的不同而表现差异[14]，并由多个基因控制，这些基因在不同生长阶段进行表达[2]。与大麦耐盐性状相关的数量性状基因座（QTL）已被定位，包括与产量和农艺因素、发芽和幼苗、植物存活、地上部Na+含量或Na/K比率和盐排斥有关的基因座[14-16]。

植物耐盐性是一个复杂的遗传过程，表现出不同的遗传性状，由不同的生理与分子机制调控。研究发现，植物不同部位对盐碱胁迫表现出各种不同的适应机制，可归纳为：高pH 胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、离子外排与离子毒害耐受性、氧化胁迫耐受性。这些机制涉及植物的不同生长发育阶段、生理特征、代谢途径、激素途径、转录反应和基因系统[17-18]。因此，了解植物不同生长阶段对盐碱胁迫的耐受性具有重要意义。此外，不同种属的植物抵御盐碱胁迫所依赖的途径不同，最终差异性体现在表型性状上。因此，需要针对不同植物、不同发育阶段筛选出盐碱胁迫敏感评价指标，建立简易、可行、有效的评价体系。已有研究表明，存活指数、相对生长抑制率和萎蔫系数等指标适宜作为耐盐碱的评价指标[19]。基于表型表现的综合指标可以从整株水平上评价抗耐性，更具直观性和便捷性。

盐碱胁迫的损害程度取决于作物的品种、盐度浓度和发育阶段[14]。芽期和苗期是作物生命周期中最关键的阶段，但对盐度最敏感，因为它决定了植物的活力和群体密度，最终影响产量[20-21]。在这一阶段，拥有能够适应盐度的品种对于易受盐度影响的种植区域至关重要，例如澳大利亚西部的干旱地区，夏季炎热干燥，秋季播种前盐度水平升高[21]。此外，种子萌发和初始幼苗生长发生在表层土壤中，由于蒸散作用，土壤中的盐含量较高[22]。因此，研究萌发期和苗期盐碱胁迫对大麦种子萌发和幼苗生长的影响及筛选耐盐碱种质对大麦遗传改良与生产具有重要意义。

本研究以292 份大麦种质为材料进行苗期的耐盐性鉴定，以苗期的相对盐害率作为筛选指标，综合苗高、根长、根条数、苗鲜重、根鲜重、苗干重、根干重、存活天数和萎蔫系数等表型性状，对大麦资源进行耐盐性鉴定与分类，以筛选出优异的耐盐大麦种质资源，为大麦耐盐性研究及新品种选育提供参考。

1.1 试验材料

试验在内蒙古通辽市科尔沁区孔家农业科技园区智能温室进行，供试292 份大麦种质由内蒙古农牧科学院大麦研究室提供，详见表1。

表1 供试大麦种质资源编号Table 1 Code and origins of tested barley germplasm resources

续表1

1.2 试验设计

苗期盐胁迫在18cm×14cm×6cm 的培养系统内进行（图1），将蛭石装入含有12 个孔的育苗盒中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盒，播种深度约1cm，每个基因型单次重复为6个孔，每个孔内播种4 粒种子。种子发芽后利用1/2 Hoagland营养液浇灌培养，待幼苗长至2叶1心期，注入200mL的100mmol·L-1Na-Cl 进行盐胁迫处理，并每2d 增加1 次盐浓度至终浓度为500mmol·L-1，并设置无胁迫液的1/2 Hoagland 营养液作为对照，每2d更换1次发芽盒内的处理液和营养液。每个处理3 次重复，胁迫处理7d后，记录每个基因型的萎蔫指数，并且每个基因型每次重复测定5株的苗高、根长、根条数、苗鲜重、根鲜重、苗干重、根干重，取平均值。

设置单独的处理进行存活天数指标的测定，具体为：将蛭石装入含有12个孔的育苗盒中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盒，每个孔播种2 粒，播种深度约1cm，每个基因型播种12 个孔，出苗后每孔挑选1株健壮幼苗留存，待幼苗长至2叶1心期，注入200mL的100mmol·L-1NaCl进行盐胁迫处理，并每2d增加1次盐浓度至终浓度为500mmol·L-1，每个基因型记录每个单株存活天数，直至每个基因型单株全部死亡。

图1 基于蛭石和改良霍格兰营养液的大麦苗期无胁迫和盐胁迫培养系统Figure 1 Non-stress and salt stress culture system of barley seedling based on vermiculite and 1/2 Hoagland nutrient solution

1.3 数据统计分析

计算苗期各指标的相对耐碱系数，即胁迫下各性状的平均值与对照下各性状的平均值的比值。采用DPSv18.10进行相关性分析、隶属函数分析、主成分分析、逐步线性回归分析及聚类分析，以构建大麦耐碱种质资源的表型评价体系。

萎蔫指数等级划分为：0级，生长正常；
1级，生长稍受抑制，只有叶尖皱缩；
2级，30%的叶片呈灰绿色，缺乏叶绿素；
3级，50%的叶片呈灰绿色，缺乏叶绿素；
4级，大多数叶片枯黄，只有心叶为绿色；
5级，几乎所有植株死亡。

存活天数利用加权平均值法计算，即存活天数=∑（胁迫天数×每天死亡株数）/总株数。隶属函数值计算公式[23]为：

式中：X(ij)为i种类j指标的隶属值；
Xij表示i种类j指标的测定值；
Xjmax、Xjmin分别为指标的最大值和最小值。

如果某一指标与抗耐性呈负相关，则采用反隶属函数计算，公式为:

2.1 盐胁迫对大麦幼苗表型的影响

由表2可知，大麦苗期盐胁迫下，各性状的相对值均小于1，表明各性状在盐胁迫下均呈降低趋势。不同性状间以相对地上鲜重的变异最大，变幅为0.08～1.00，变异系数为33.62%；
以存活天数的变异最小，变幅为11.00～30.23，变异系数为11.79%。7 个农艺性状（苗高、根长、根条数、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重）在处理与对照之间均存呈极显著差异，在盐胁迫处理条件下，各性状表型值较对照都显著降低。

2.2 盐胁迫下性状间的相关分析

由表3可知，盐胁迫下，存活天数与萎蔫系数呈极显著负相关，相关系数为-0.51（p＜0.01）；
相对苗高与相对根条数、相对地上鲜重、地下鲜重和相对地上干重呈极显著正相关，相关系数分别为0.21（p＜0.01）、0.62（p＜0.01）、0.21（p＜0.01）和0.62（p＜0.01），与相对地下干重呈显著正相关（p＜0.05），与萎蔫系数呈极显著负相关（p＜0.01）；
相对根长与相对地上鲜重、相对地下鲜重、相对地上干重和相对地下干重呈极显著正相关，相关系数分别为0.15（p＜0.01）、0.27（p＜0.01）、0.15（p＜0.01）和0.26（p＜0.01）；
相对根条数与相对地上鲜重、相对地下鲜重、相对地上干重和相对地下干重呈极显著正相关，相关系数分别为0.39（p＜0.01）、0.34（p＜0.01）、0.25（p＜0.01）和0.28（p＜0.01）；
相对地上鲜重与相对地下鲜重、相对地上干重和相对地下干重呈极显著正相关，相关系数分别为0.48（p＜0.01）、0.71（p＜0.01）和0.43（p＜0.01）；
相对地下鲜重与相对地上干重和相对地下干重呈极显著正相关，相关系数分别为0.33（p＜0.01）和0.74（p＜0.01）；
相对地上干重与相对地下干重呈极显著正相关（p＜0.01）。

表2 盐胁迫下大麦种质资源各性状指标表现Table 2 Average performance of each character index of barley germplasm resources under salt stress

表3 盐胁迫下大麦种质各性状的相关性分析Table 3 Correlation analysis of barley germplasm traits under salt stress

2.3 大麦耐盐性综合分析

2.3.1 农艺性状的主成分与赋权综合评价 由于单个农艺指标评价耐盐性存在信息不全和盲目性等问题。故在各单项指标之间相关关系研究的基础上，利用主成分分析，将对各单项指标的信息进行提取综合成几个综合指标，并使这几个综合指标尽可能多地保留原来多个单项指标所反映的信息。

本研究中，对292 份大麦种质的7 个农艺性状指标进行主成分分析（表4），并根据各主成分的特征值和贡献率进行主成分提取。由表4可知，前4个主成分代表大麦种质碱胁迫下各表型性状87.57%的遗传信息量，可代替7个农艺性状指标的绝大部分信息，综合反映盐胁迫下大麦苗期耐盐型特性，可以作为大麦耐盐种质评价的综合指标。由表5 可知，第1 主成分贡献率为45.17%，主要与地上地下鲜重和地上地下干重相对值有关，主要反应大麦生物量相关的盐害性状。第2主成分贡献率为18.81%，主要与根长、地下鲜重和地下干重有关，主要反应大麦地下部的盐害性状。第3主成分和第4主成分贡献率分别为13.53%和10.05%，主要与根长和根条数有关，主要反应大麦地下部的盐害性状。

表4 大麦7个农艺性状指标的主成分的方差贡献率Table 4 Variance contribution rate of principal components of 7 traits in barley

表5 大麦7个农艺性状耐盐指数的主成分载荷矩阵Table 5 Principal component load matrix of salt tolerance index of 7 traits in barley

2.3.2 基于隶属函数值、综合评价指数值与系统聚类的大麦耐盐综合评价 通过主成分分析将7 个农艺性状进行综合分析，获得292 份大麦种质的综合得分F，将综合得分F值作为综合指标。利用隶属函数法计算综合指标F与萎蔫系数和存活天数两个综合指标的总隶属函数值SUM，作为评价耐盐性强弱标准的度量值，SUM值越大，耐盐性越强，并对292份大麦种质进行排序（表6）。

由表6 可知，总隶属函数值为0.46～2.37，综合排名前10 的大麦种质从大到小依次为：283（Traditon）、238（WDM2325）、78（NDB112）、186（龙09Y1-199）、185（2801）、246（Moroccan Landrace）、284（Portuguese Landrace）、77（F7 不育×Troubadour）、84（Cevada Preta）和179（STELLAR）；
综合排名后10的种质从小到大依次为：120（F3×甘啤4 号2）、119（京308-1）、117（垦啤麦8 号）、118（ROSA）、111（鄂大麦259）、46（加-06）、74（NOIRE MAROC）、29（加-060711）、282（F6×甘啤4号2）和122（川农大4号）。

表6 盐胁迫下292份大麦种质的SUM值排名Table 6 SUM ranking of 292 barley germplasms under salt stress

续表6

以参试材料表型性状及SUM值进行逐步回归分析，并构建逐步回归方程以用于耐盐种质的筛选，构建方程为：

式中：X1、X3、X4、X5、X6、X8和X9分别代表相对苗高、相对根条数、相对地上鲜重、相对地下鲜重、相对地上干重、存活天数和萎蔫系数。该方程的相关系数为0.9402，决定系数为0.9402，表明X1、X3、X4、X5、X6、X8和X9这7 个变量可以决定总SUM值总变异的94.02%，该方程可用于大麦种质资源耐盐性的筛选与评价。

2.3.3 系统聚类 根据各品种的总隶属函数值进行聚类分析，划分为4 类不同类型的品种（图2），其中第1类（I）为耐盐型，包括66个品种；
第2类（II）为中度耐盐型，包括178个品种；
第3类（III）为盐敏感型，包括43 个品种；
第4 类（IV）为盐极敏感型，包括5个品种。

培育耐盐碱品种是应对土壤盐渍化较经济有效的途径。已有研究表明，苗期耐盐性与其他营养生长和生殖生长阶段的耐盐性无关[24]，可能对作物产量产生负面影响[25]，包括单株分蘖数和地上部生物量[26]、开花时间[27]和收获指数[28]等。需要培育苗期耐盐性作物，以提高作物在盐分胁迫下保持良好产量的能力。因此，在生育早期鉴定具有较强耐盐能力的耐盐品种至关重要。

图2 参试材料的聚类分析Figure 2 Cluster analysis of the tested materials

耐盐育种需要可靠、快速的筛选技术，由于土壤和环境的异质性，很难在田间条件下进行筛选。尽管通过设置多年和多个环境的表型筛选试验，一定程度上可以提高选择的可靠性，但这会增加育种成本。本研究在模拟田间条件下，并在受控条件下尽量减少环境因素的影响，使用蛭石和珍珠岩加营养液的方式，通过盆栽在大麦生长早期评估其耐盐碱性，提高了筛选的效率性和可靠性。

迄今，已有一系列农艺、产量和生理性状应用于耐盐性的评价与鉴定，如产量形成相关指标[29-30]、生物量相关指标（相对生长率、株高、地上部鲜重、地上部干重、根鲜重和根干重等）[31-33]、光合相关指标（气孔导度、光合参数、叶绿素荧光、净光合速率和叶绿素含量等）[30,34-35]、叶片和根系形态（叶面积、叶片伸展速率、根长、根体积和根分枝数）[30,32,36-37]、生理指标（相对含水量、根系活力、甜菜碱、过氧化物酶、可溶性蛋白等）[38-39]、离子指标（Na+、K+）[40-41]等。这些性状在多种植物中被证实与耐盐性显著相关，有些也已在大麦育种中用作耐盐性筛选指标。然而，哪些性状可作为大麦耐盐性基因型筛选的最佳指标，尚需深入分析[42]。

本研究使用苗高、根长、根条数、苗鲜重、根鲜重、苗干重、根干重、存活天数和萎蔫系数等指标进行耐盐性评价，其中存活天数和萎蔫系数与其他指标间未有显著关系，且存活天数和萎蔫系数是耐盐性评价综合指标[43]。因此，首先对苗高、根长、根条数、苗鲜重、根鲜重、苗干重和根干重进行主成分分析，将几个指标进行综合分析，获得一个综合指标，即综合得分因子F值，再以综合得分F值与存活天数和萎蔫系数进行隶属函数分析，获得总隶属函数，通过对总隶属函数值进行聚类分析，获得耐盐型品种66个。通过各指标与总隶属函数的回归分析发现，相对苗高、相对根条数、相对地上鲜重、相对地下鲜重、相对地上干重、存活天数和萎蔫系数等指标能充分反映大麦的耐盐性，是表现植物生长情况的最直观证据[44]，可作为大麦苗期耐盐性筛选指标。

选择耐盐大麦资源是遗传育种改良的基础。尽管过去几十年里，科学家们从国内外的大麦资源中鉴定到很多耐盐品种[45]，并在大麦耐盐性的遗传研究上取得长足进展[46]，但是针对耐盐性的遗传机制仍不十分清楚。要阐明这些机制，可能需要多个基因共同作用才能改善大麦耐盐性。因此，继续研究大麦耐盐性种质的筛选，研究其遗传机制，以确定更多的耐盐基因对大麦耐盐性遗传改良至关重要。

使用传统的育种方法，科学家培育出了一系列耐盐大麦品种，如苏啤4号、苏啤6号等，但耐盐性的遗传改良较为缓慢。目前，已从不同的大麦基因型中分离、鉴定到许多基因/QTL，但是这些基因/QTL还未充分应用到育种中，育种效率亟待提高。随着生物技术的快速发展，基于分子标记辅助选择、大田鉴定结合小包子培养技术形成的育种体系在大麦耐盐育种中潜力巨大，能够极大提高大麦耐盐育种的效率。该育种体系应用的瓶颈是分子标记对复杂性状的预见性较差，盐害作为一个复杂的数量性状，可能存在基因间的互作，通常还受环境影响，如温度等。解决这一问题可从两方面入手：（1）仍需筛选更多耐盐种质资源，挖掘优特异资源，分离优异主效基因，确定哪些基因适于耐盐品种改良和分子辅助选择；
（2）通过耐盐基因的挖掘，利用基因编辑技术，直接进行品种的耐盐性改良。

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