褐马鸡繁殖期和非繁殖期血液转录组的比较分析※

●任倩俐 苏 凯 姚 丽 李金邦 张 敬 张丽霞※※

（1.太原动物园 山西 太原 030009；
2.北京动物园管理处 北京 100044；
3.北京动物园圈养野生动物技术北京市重点实验室 北京 100044）

褐马鸡（Crossoptilon mantchuricum）是我国特有的濒危珍稀雉类，全球现存约17 900只，被IUCN红色名录列为易危物种。目前仅分布于山西、北京、河北和陕西，其中山西是其主要分布省份[1]。为了保护这一珍稀鸟类，多年来学者们在形态学、繁殖生物学、生态学、保护生物学等领域对褐马鸡进行了广泛的研究，但关于褐马鸡繁殖及生长发育的功能基因以及相关生物学现象的分子机制研究较少，转录组学的研究处于空白状态，若想揭示、利用褐马鸡生长发育、应激生理、抗病免疫等作用机制，则需要了解其遗传信息。由于褐马鸡为国家一级保护动物，采集组织器官对其进行转录组分析不现实，血液样本的采集操作简单，对动物的伤害较小，适用于褐马鸡繁育机制的研究。截至目前，血液转录组分析已经在多个哺乳动物中完成，如北极熊、棕熊[2]、人[3-4]、猪[5]、牛[6]和大熊猫[7]等。同时相关研究表明，禽类就巢期间，血液中PRL（催乳素）、FSH（促卵泡素）等激素的含量会增多[8]，因此可以从血液转录本在褐马鸡繁殖期前后的变化发现其基因调控机制。本试验以褐马鸡为研究对象，通过探究其在繁殖期和非繁殖期的基因表达模式和分子调控机制的变化，为褐马鸡季节性行为策略、濒危机制、生态学研究及保护遗传学的研究提供理论依据。

1.1 样本采集及RNA测序

在太原动物园褐马鸡繁育基地选取健康的3龄成鸟2对，体重约5 kg，编号为7L195♀，7L181♂，7L346♀，7L297♂（以下简称 HC1、HX1、HC2、HX2）。在5月和10月分别采用翼下采血法提取褐马鸡的血液样本，每份样本采集2.5 mL全血至 EDTA 采血管中，加入7.5 mL TriZol裂解液混匀，立刻转入耐-192℃低温的螺纹口冻存管中，干冰用于RNA样品制备、检验和测序（表1）。

表1 样品名编号

1.2 差异表达基因的筛选

1.3 差异表达基因的GO分类、KEGG富集分析

在BlastGO软件中将差异表达基因的序列与GO（Gene Ontology）数据库进行注释和富集分析；
通过BlastX软件将差异表达基因与KEGG数据库比对，使用在线注释工具KAAS对核酸和蛋白质序列进行功能注释并分析基因代谢途径[9]。

2.1 RNA测序质量控制

采用琼脂糖凝胶电泳法对样品进行检测，结果表明，样本总RNA的纯度较高，符合转录测序cDNA 文库构建对RNA质量的要求。统计了下机原始数据每个样本的Reads 数以及总数据量（表2），各项数据符合要求，可用于生物信息学分析。组装后褐马鸡全基因组测序共获得 16.1 Gbp 数据，39 907 条 Unigenes，总长度为 39 002 861 bp，平均长度为 324 bp。

表2 转录组测序产量统计

2.2 差异表达基因的筛选

将8个样本中的重复样本混合后组合成3个对照组，即HC10 vs HC05（非繁殖期和繁殖期雌性）、HX10 vs HX05（非繁殖期和繁殖期雄性）、HC05 vs HX05（繁殖期雌性和雄性）。结果显示，非繁殖期与繁殖期的雌鸡进行比较，有4007条差异基因表达，上调基因数目为2567，下调基因数目为1440；
非繁殖期与繁殖期的雄鸡进行比较，差异基因数目为3529，上调基因数目为2313，下调基因数目为1216；
繁殖期的雌鸡和雄鸡相比较，有336条差异基因表达，上调的基因数目为150，下调的基因数目为186（图1）。

图1 差异表达基因火山图

经比较，HC10 vs HC05对照组中，非繁殖期雌性褐马鸡体内Mucl2、HBE1、Col1a1、Klk1b22、Col1a2基因表达量显著高于繁殖期的雌性褐马鸡；
HX10 vs HX05对照组中，非繁殖期雄性褐马 鸡 体 内MT-CO3、MT-ND4、EEF1A1、MTCO1基因表达量显著高于繁殖期的雄性褐马鸡；
HC05 vs HX05对照组中，繁殖期雌性褐马鸡体内HINT1、TXNL1、Txnl1、AVD、vcp基因表达量显著高于雄性褐马鸡（表3）。这些基因是与褐马鸡生长发育、激素调控、性别决定、免疫、代谢、酶活性、线粒体等生命活动息息相关的基因，这些基因的表达与调控从分子水平上揭示了褐马鸡在性别之间、季节变化方面的不同行为。

表3 比较组部分差异表达基因

2.3 差异基因的GO富集分析

对各个对照组的差异表达基因进行表达模式聚类分析，以了解其在生物过程中的功能分类，包括生物学过程、细胞组分和分子功能，即GO富集分析。结果表明，有174个与繁殖功能相关的基因比对到GO数据库中，其中，非繁殖期与繁殖期的雌鸡进行比较，4007个差异基因中有2762个得到注释，15个基因参与繁殖调节相关的信号通路；
非繁殖期和繁殖期的雄鸡进行比较，3529个差异基因中有2526个得到注释，143个基因参与繁殖调节相关的信号通路；
繁殖期的雌鸡和雄鸡相比较，336个差异基因中有222个得到注释，16个基因参与了繁殖调节相关的信号通路。将P-value值设置为小于0.05，所有的差异基因显著富集到了10 147条GO terms中，占所有 terms的21.66%。

在生物学过程中，有305个基因注释到翻译（Translation）类别中，数量最多，其次为DNA模 板 转 录（Transcription，DNA-templated） 和DNA 模板的转录调控（Regulation of transcription，DNA-templated）；
在细胞组分中，有525个基因注释到核（Nucleus），数量最多，其次为细胞质（Cytoplasm）和细胞外体（Extracellular exosome）；
在分子功能中，有527个基因注释到蛋白质结合（Protein binding），其次为三磷酸腺苷结合（ATP binding）和核糖体的结构组成（Structural constituent of ribosome）。

HC10 vs HC05比较组中，在非繁殖期的高表达基因发现了TGFB1、ACVR1B和BCL2L1 3个基因涉及褐马鸡的繁殖调控机制。TGFB1（转化生长因子β-1前蛋白前体）编码的蛋白质参与到促卵泡素正调节、黄体生成素正调节、孕酮分泌、凋亡过程调控等过程；
ACVR1B基因（激活素受体1B型亚型X1）编码的蛋白与抑制素（INH）结合有关，抑制素在生物学功能上通过对促卵泡素（FSH）的负反馈调节，进而对雌性褐马鸡在非繁殖期的各类行为进行调控；
BCL2L1基因（Bcl-2家族蛋白复合物）是B 细胞白血病淋巴瘤2p家族基因，是决定生殖细胞命运的重要基因，在雌性褐马鸡的非繁殖期参与到了细胞凋亡和生殖细胞、卵泡发育的调控。

2.4 差异基因的KEGG富集分析及代谢通路

KEGG通路分析结果显示，HC10 vs HC05对照组中有2509个差异基因富集到311个信号通路上；
HX10 vs HX05对照组中有2300个差异基因富集到309个信号通路中；
HC05 vs HX05对照组中有210个差异基因富集到130个信号通路中。88个差异基因在KEGG代谢通路中均参与了与繁殖相关的信号通路中，有22个基因富集到卵母细胞减数分裂（Ocyte meiosis），29个基因富集到 GnRH 信号通路（GnRH signaling pathway，促性腺激素释放激素）、19个基因富集到孕酮介导的卵母细胞成熟（Progesterone-mediated ocyte maturation）、13个基因富集到催产素（Oxytocin signaling pathway）、5个基因富集到雌激素代谢通路（Estrogen signaling pathway）。

动物随季节变化产生的规律性活动，不仅受环境因素的影响，也与自身内源性节律调控有关，而参与繁殖调控的相关基因往往在年度周期中有着节律性的表达变化，并且在调节季节性活动变化中发挥重要功能。褐马鸡作为我国特有的濒危珍禽，其种群数量少，分布范围小，样本采集困难，随着保护生物学研究的不断深入，笔者发现除了保护栖息地之外，更重要的是保护其遗传多样性。

随着RNA-Seq 技术的发展应用，转录组测序以检测范围广、测序通量高、检测成本低、分辨率好和灵敏度高等特点，已被广泛应用于非模式生物以及低丰度稀有转录本相关基因挖掘与研究。本研究通过高通测序技术，获取了不同繁育阶段、不同性别褐马鸡血液转录组信息，构建褐马鸡血液转录组文库，共得到39 907条Unigenes，通过GO功能富集和KEGG分析，发现有174个与繁殖功能相关的基因比对到GO数据库中，有88个基因在KEGG代谢通路中参与到了与繁殖相关的代谢通路。在差异基因的GO分析中，TGFB1、ACVR1B和BCL2L1 3个基因在非繁殖期雌性褐马鸡体内高表达，它们参与了促卵泡素、抑制素、孕酮的激素调控以及生殖细胞、卵泡的调控，从分子层面揭示了基因表达量的变化影响激素分泌进而影响褐马鸡季节性行为策略；
雌性褐马鸡非繁殖期和繁殖期对照组中，在Biological process中找到了与繁殖相关的功能组，此结果与陈杰[10]鹅的产蛋性能的影响基因研究结果相似，说明繁殖性能与GO注解中的这几个进程相关。本研究结果既丰富褐马鸡的转录组信息，也为今后开展褐马鸡遗传学研究、分子调控机制以及濒危动物的保护工作奠定了基础。

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