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鸡传染性支气管炎·H9亚型禽流感病毒与鸡毒支原体混合感染的诊治

来源:专题范文 时间:2024-01-12 09:19:02

江晓阳,王 艳,刘俊镛,刘 旭,高亚东,孙景煜,张 越,尹建华

(青岛汇丰动物保健品有限公司,山东青岛 266109)

鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒引起鸡的一种急性、高度接触性的呼吸道传染病,其临床症状为呼吸困难、发出啰音、张口呼吸、咳嗽,夜间关灯后症状尤为明显[1-2]。如果病原不是肾病变型毒株或不发生并发病,死亡率较低;
若是肾病变型毒株,可能在肝脏等器官看到白色尿酸盐沉积,死亡率在20%左右[3]。

禽流感是禽流感病毒引起的一种对养鸡业危害较大的一种疾病,根据不同致病性分为高致病性毒株、低致病性中弱毒株和非致病性无毒株[4]。高致病性毒株导致的病死率可达100%;
有些低致病性毒株导致的鸡死亡率为0~15%,另外饲养管理不当、鸡群营养状况不良以及环境应激因素都可能加重病情,当发生并发感染时可使鸡群死亡率升高[5]。

鸡毒支原体感染是鸡的一种慢性呼吸道病,流行于全世界鸡场中,在国内也普遍发生。根据血清学调查可知,鸡毒支原体平均感染率为70%~80%[6]。感染鸡通常表现为气管啰音、咳嗽、流鼻涕、流眼泪,一侧或两侧眼睑肿胀或黏合[7]。一般来说,鸡死亡率较低,发生环境应激或者并发感染时鸡死亡率升高,鸡毒支原体常与呼吸道有关的疾病伴发[8]。

春秋季节肉鸡多发呼吸道疾病,引起心衰、肺出血、水肿、发黑,甚至死亡,俗称“心肺病”或“黑肺病”,引起这种疾病的病因尚不清楚。有人认为,这是因为鸡场暴发过支原体感染,当时根除不彻底,后期又感染了其他呼吸道疾病或细菌感染;
也有报道认为,引起该病的主要病原为低致病性禽流感病毒,又混合感染了其他细菌或病毒。大多数人认为,该病为混合感染,增加了该病的诊断难度[9]。笔者通过病理学解剖、细菌分离培养、病毒分离鉴定、动物回归试验和分子生物学检测对山东省日照市某发病鸡场5只病死鸡进行病因诊断,旨在为该病的防治与诊断提供参考。

1.1 试验对象山东省日照市某肉鸡场病死鸡5只、同一种鸡场1日龄雏鸡20只、10日龄SPF鸡胚15枚。

1.2 试验仪器电热恒温培养箱(型号300,购自龙口市先科仪器公司);
PCR扩增仪(型号A300,购自杭州朗基科学仪器有限公司);
电泳仪(型号DYY-6C型,购自北京六一仪器厂);
凝胶成像系统(Bio-Rad GelDoc XR,购自南京贝登医疗股份有限公司);
孵化器(购自山东德州旭升孵化设备研制中心)。

1.3 试验试剂营养琼脂、麦康凯培养基、SS琼脂,均购自青岛海博生物技术有限公司;
病毒组基因DNA/RNA提取试剂盒、 2× AccurateTaq预混液,均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1临床诊断和剖检。询问并记录鸡群状态,检查病死鸡体表并进行剖检,无菌采集相关病变组织(留下部分肝脏),将病变组织与生理盐水按1∶2的质量比匀浆,反复冻融3次后离心取上清,备用(编号01)。

1.4.2细菌分离与培养。将无菌采集的肝脏按照细菌分离培养的方法接种到营养琼脂、麦康凯培养基、SS培养基上,置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

1.4.3病毒分离鉴定。实验组取01号取组织液,经0.22 μm滤器过滤后,接种于10枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔中。连续观察72 h,每次间隔8 h,记录死亡数。收取尿囊液以及胚体,供血凝试验以及分子生物学检测(编号02)。

对照组取无菌生理盐水,经0.22 μm滤器过滤后,接种于5枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔中。连续观察72 h,每次间隔8 h,记录死亡数;
收取尿囊液以及胚体,供血凝试验以及分子生物学检测(编号03)。

1.4.4动物回归试验。将20只雏鸡分成3组:一组12只,进行攻毒试验(试验组),另一组5只注射生理盐水(对照组),剩余3只(空白组)按相关病变组织无菌采集相应的组织,将组织与生理盐水按1∶2的质量比匀浆后,反复冻融3次、离心,取上清备用(编号04)。

取编号01组织液,对试验组7日龄肉鸡进行攻毒,攻毒方式为腿部肌肉注射和口服各0.2 mL。取无菌生理盐水,对对照组7日龄肉鸡进行攻毒,攻毒方式为腿部肌肉注射和口服各0.2 mL。攻毒后观察试验组和对照组鸡群的发育状态,连续观察14 d,每天观察3~4次,于15日龄分别采集口、鼻以及泄殖腔棉拭子,试验组编号05,对照组编号06。

在观察过程中记录鸡群状态,及时处理死亡鸡只,无菌采集病料,将病料与生理盐水按1∶2的质量比匀浆,反复冻融3次,离心后取上清,备用。第15天,对所有鸡只进行处理,无菌采集相关病料,试验组死亡鸡只编号07、存活鸡只编号08,对照组死亡鸡只编号09、存活鸡只编号10。

1.4.5分子生物学检测。对上述所有编号的组织液以及尿囊液,根据核酸提取试剂盒说明书步骤提取核酸,并对提取的RNA进行反转录,得到cDNA;
用家禽常患呼吸道疾病病毒的引物进行扩增后,取6~7 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,最后通过凝胶成像系统观察是否存在目的条带。

反转录体系:dNTP Mixture 2.0 μL、5×Buffer 4.0 μL、M-MLV 0.5 μL、Random Primer(nonadeoxyribonucleotide mixture;pd(N)9)1.0 μL、Recombinant RNase Inhibitor 0.5 μL、RNA 12.0 μL,总体积为20.0 μL。

反转录程序:30 ℃ 10 min,42 ℃ 1 h,4 ℃下保存。

PCR扩增体系:ddH2O 8.5 μL、2× AccurateTaqMix 12.5 μL、上游引物 1.0 μL、下游引物 1.0 μL、DNA/cDNA 2.0 μL,总体积25.0 μL。

PCR扩增程序:预变性95 ℃ 5 min;
95 ℃ 42 s,48~60 ℃ 42 s,72 ℃ 1 min,共35个循环;
延伸72 ℃ 10 min,4 ℃下保存。

2.1 临床诊断和剖检山东省日照市某鸡场突然发病,以呼吸道症状为主,经询问养殖场老板了解到该养殖场曾暴发过鸡毒支原体感染,经过一段时间净化后鸡群比较稳定,该批鸡苗进场前鸡场已彻底清洗消毒,鸡苗进场前免疫新城疫禽流感二联苗,7日龄免疫鸡传染性支气管炎4/91 QX型二联减毒疫苗,前期鸡群发育正常,15日龄个别鸡出现气喘,18日龄鸡群出现咳嗽,关灯后尤为明显,并出现鸡只死亡,严重时死亡率高达18%。对死亡鸡只进行病理学剖检,发现支气管栓塞、气管喉头出血、肺出血水肿发黑、气囊增厚且有干酪物、肝脏肿大、肾脏肿大、输尿管有尿酸盐沉淀、法氏囊肿大[10](图1)。

注:A.支气管栓塞;
B.气管喉头出血;C.肺出血水肿发黑。Note:A.Bronchial embolism;B.Trachea laryngeal hemorrhage;C.Pulmonary edema,bleeding and blackening.图1 病死鸡剖检结果Fig.1 Autopsy results of dead chickens

2.2 细菌分离培养在营养琼脂、麦康凯培养基、SS培养基上,37 ℃恒温培养箱中培养24 h后,经观察未发现有细菌菌落生长(图2)。

注:A.营养琼脂;B.SS培养基;C.麦康凯培养基。Note:A.Nutrient Agar;B.Salmonella Shigella Agar;C.Maconkey Agar.图2 细菌分离培养结果Fig.2 Results of bacteria isolation and culture

2.3 病毒分离鉴定试验组:接种鸡胚后,前48 h鸡胚发育正常,48 h后鸡胚血管轻微脱落,64 h鸡胚全部死亡。收取尿囊液,经血凝试验发现有血凝现象发生,血凝效价为26。

对照组:接种鸡胚后,鸡胚发育正常,无死亡;
64 h终止孵化,收取尿囊液后经血凝试验未发现有血凝现象发生。

2.4 动物回归试验攻毒前对试验雏鸡进行病理学剖检,未发现明显的病理变化。试验组试验前期雏鸡生长发育正常,14日龄出现鸡只羽毛蓬松、精神萎靡,有呼吸症状;
16日龄死亡3只;
17日龄死亡4只;
18日龄死亡2只,剩余3只鸡未死亡,但发育迟缓,采食量及饮水量下降。

对试验组死亡鸡只进行剖检,发现脾脏肿大出血,胰腺出血,腺胃黏膜易脱落,胃壁增厚、法氏囊肿大、有黏液,肺水肿出血,气管喉头出血,胸腺出血,肾肿大出血,气囊增厚、个别有干酪物。

对试验组未死亡鸡只进行剖检,其中2只鸡法氏囊肿大,另1只鸡组织器官正常;
1只鸡气囊有干酪物,肺出血,肝脏正常,肾脏出血,法氏囊肿大、有黏液,气管出血,肠道血管充血。

对照组鸡只未死亡,发育正常,病理学剖检未发现明显的病理变化。

2.5 分子生物学检测对试验中所有编号样品进行PCR检测,检测结果如图3~6所示。

注:M为 DNA Marker 1 000;
1.病死鸡组织液;
2.试验组鸡胚尿囊液;
3.对照组鸡胚尿囊液;
4.空白组鸡只组织液;
5.试验组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;
6.对照组口、鼻以及泄殖腔棉拭子:7.试验组死亡鸡组织液;
8.试验组未死亡鸡组织液;
10.对照组未死亡鸡组织液。Note:M.DNA Marker 100 0;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth,nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth,nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.图3 禽流感病毒PCR检测结果Fig.3 PCR results of avian influenza virus

注:M为DNA Marker 1 000;
1.病死鸡组织液;
2.试验组鸡胚尿囊液;
3.对照组鸡胚尿囊液;
4.空白组鸡组织液;
5.试验组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;
6.对照组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;7.试验组死亡鸡组织液;
8.试验组未死亡鸡组织液;
10.对照组未死亡鸡组织液。Note:M.DNA Marker 1 000;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth,nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth,nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.图4 H9亚型禽流感病毒PCR检测结果Fig.4 PCR results of avian influenza H9 subtype virus

注:M为DNA Marker 1 000;
1.病死鸡组织液;
2.试验组鸡胚尿囊液;
3.对照组鸡胚尿囊液;
4.空白组鸡组织液;
5.试验组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;
6.对照组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;7.试验组死亡鸡组织液;
8.试验组未死亡鸡组织液;
10.对照组未死亡鸡组织液。Note:M.DNA Marker 1 000;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth,nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth,nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.图5 鸡毒支原体PCR检测结果Fig.5 PCR results of Mycoplasma gallisepticum

注:M为DNA Marker 1 000;
1.病死鸡组织液;
2.试验组鸡胚尿囊液;
3.对照组鸡胚尿囊液;
4.空白组鸡组织液;
5.试验组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;
6.对照组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;7.试验组死亡鸡组织液;
8.试验组未死亡鸡组织液;
10.对照组未死亡鸡组织液。Note:M.DNA Marker 1 000;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth,nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth,nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.图6 鸡传染性支气管炎病毒PCR检测结果Fig.6 PCR results of avian infectious bronchitis virus

通过将病死鸡病料组织液接种在鸡胚上,可使鸡胚致死,并且有血凝现象发生,说明病料含有毒力较强的血凝性病原;
动物回归试验发现,鸡死亡率达75%,说明病毒致死性强;
通过分子生物学检测确定鸡群发生了鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒混合感染。动物回归试验结果表明,试验组H9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒检测结果呈阳性,说明试验组前期发生了鸡传染性支气管炎和H9亚型禽流感病毒排毒,后期死亡鸡未检出鸡传染性支气管炎病毒,H9亚型禽流感病毒和鸡毒支原体检测结果呈阳性;
未死亡鸡检测出鸡毒支原体;
对照组未检出阳性病原。综上所述,该鸡场前期可能发生鸡毒支原体隐性感染,机体免疫力低下。使用鸡传染性支气管炎4/91 QX型二联减毒疫苗免疫后,随着时间的推移,疫苗毒力累计量增加,进一步损害机体免疫器官,导致继发感染H9亚型禽流感病毒,出现大量鸡只死亡。

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