鸡传染性支气管炎·H9亚型禽流感病毒与鸡毒支原体混合感染的诊治

江晓阳，王 艳，刘俊镛，刘 旭，高亚东，孙景煜，张 越，尹建华

(青岛汇丰动物保健品有限公司，山东青岛 266109)

鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒引起鸡的一种急性、高度接触性的呼吸道传染病，其临床症状为呼吸困难、发出啰音、张口呼吸、咳嗽，夜间关灯后症状尤为明显[1-2]。如果病原不是肾病变型毒株或不发生并发病，死亡率较低；
若是肾病变型毒株，可能在肝脏等器官看到白色尿酸盐沉积，死亡率在20%左右[3]。

禽流感是禽流感病毒引起的一种对养鸡业危害较大的一种疾病，根据不同致病性分为高致病性毒株、低致病性中弱毒株和非致病性无毒株[4]。高致病性毒株导致的病死率可达100%；
有些低致病性毒株导致的鸡死亡率为0～15%，另外饲养管理不当、鸡群营养状况不良以及环境应激因素都可能加重病情，当发生并发感染时可使鸡群死亡率升高[5]。

鸡毒支原体感染是鸡的一种慢性呼吸道病，流行于全世界鸡场中，在国内也普遍发生。根据血清学调查可知，鸡毒支原体平均感染率为70%～80%[6]。感染鸡通常表现为气管啰音、咳嗽、流鼻涕、流眼泪，一侧或两侧眼睑肿胀或黏合[7]。一般来说，鸡死亡率较低，发生环境应激或者并发感染时鸡死亡率升高，鸡毒支原体常与呼吸道有关的疾病伴发[8]。

春秋季节肉鸡多发呼吸道疾病，引起心衰、肺出血、水肿、发黑，甚至死亡，俗称“心肺病”或“黑肺病”，引起这种疾病的病因尚不清楚。有人认为，这是因为鸡场暴发过支原体感染，当时根除不彻底，后期又感染了其他呼吸道疾病或细菌感染；
也有报道认为，引起该病的主要病原为低致病性禽流感病毒，又混合感染了其他细菌或病毒。大多数人认为，该病为混合感染，增加了该病的诊断难度[9]。笔者通过病理学解剖、细菌分离培养、病毒分离鉴定、动物回归试验和分子生物学检测对山东省日照市某发病鸡场5只病死鸡进行病因诊断，旨在为该病的防治与诊断提供参考。

1.1 试验对象山东省日照市某肉鸡场病死鸡5只、同一种鸡场1日龄雏鸡20只、10日龄SPF鸡胚15枚。

1.2 试验仪器电热恒温培养箱(型号300，购自龙口市先科仪器公司)；
PCR扩增仪(型号A300，购自杭州朗基科学仪器有限公司)；
电泳仪(型号DYY-6C型，购自北京六一仪器厂)；
凝胶成像系统(Bio-Rad GelDoc XR，购自南京贝登医疗股份有限公司)；
孵化器(购自山东德州旭升孵化设备研制中心)。

1.3 试验试剂营养琼脂、麦康凯培养基、SS琼脂，均购自青岛海博生物技术有限公司；
病毒组基因DNA/RNA提取试剂盒、 2× AccurateTaq预混液，均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1临床诊断和剖检。询问并记录鸡群状态，检查病死鸡体表并进行剖检，无菌采集相关病变组织(留下部分肝脏)，将病变组织与生理盐水按1∶2的质量比匀浆，反复冻融3次后离心取上清，备用(编号01)。

1.4.2细菌分离与培养。将无菌采集的肝脏按照细菌分离培养的方法接种到营养琼脂、麦康凯培养基、SS培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

1.4.3病毒分离鉴定。实验组取01号取组织液，经0.22 μm滤器过滤后，接种于10枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔中。连续观察72 h，每次间隔8 h，记录死亡数。收取尿囊液以及胚体，供血凝试验以及分子生物学检测(编号02)。

对照组取无菌生理盐水，经0.22 μm滤器过滤后，接种于5枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔中。连续观察72 h，每次间隔8 h，记录死亡数；
收取尿囊液以及胚体，供血凝试验以及分子生物学检测(编号03)。

1.4.4动物回归试验。将20只雏鸡分成3组：一组12只，进行攻毒试验(试验组)，另一组5只注射生理盐水(对照组)，剩余3只(空白组)按相关病变组织无菌采集相应的组织，将组织与生理盐水按1∶2的质量比匀浆后，反复冻融3次、离心，取上清备用(编号04)。

取编号01组织液，对试验组7日龄肉鸡进行攻毒，攻毒方式为腿部肌肉注射和口服各0.2 mL。取无菌生理盐水，对对照组7日龄肉鸡进行攻毒，攻毒方式为腿部肌肉注射和口服各0.2 mL。攻毒后观察试验组和对照组鸡群的发育状态，连续观察14 d，每天观察3～4次，于15日龄分别采集口、鼻以及泄殖腔棉拭子，试验组编号05，对照组编号06。

在观察过程中记录鸡群状态，及时处理死亡鸡只，无菌采集病料，将病料与生理盐水按1∶2的质量比匀浆，反复冻融3次，离心后取上清，备用。第15天，对所有鸡只进行处理，无菌采集相关病料，试验组死亡鸡只编号07、存活鸡只编号08，对照组死亡鸡只编号09、存活鸡只编号10。

1.4.5分子生物学检测。对上述所有编号的组织液以及尿囊液，根据核酸提取试剂盒说明书步骤提取核酸，并对提取的RNA进行反转录，得到cDNA；
用家禽常患呼吸道疾病病毒的引物进行扩增后，取6～7 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，最后通过凝胶成像系统观察是否存在目的条带。

反转录体系：dNTP Mixture 2.0 μL、5×Buffer 4.0 μL、M-MLV 0.5 μL、Random Primer(nonadeoxyribonucleotide mixture;pd(N)9)1.0 μL、Recombinant RNase Inhibitor 0.5 μL、RNA 12.0 μL，总体积为20.0 μL。

反转录程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，4 ℃下保存。

PCR扩增体系：ddH2O 8.5 μL、2× AccurateTaqMix 12.5 μL、上游引物 1.0 μL、下游引物 1.0 μL、DNA/cDNA 2.0 μL，总体积25.0 μL。

PCR扩增程序：预变性95 ℃ 5 min；
95 ℃ 42 s，48～60 ℃ 42 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；
延伸72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。

2.1 临床诊断和剖检山东省日照市某鸡场突然发病，以呼吸道症状为主，经询问养殖场老板了解到该养殖场曾暴发过鸡毒支原体感染，经过一段时间净化后鸡群比较稳定，该批鸡苗进场前鸡场已彻底清洗消毒，鸡苗进场前免疫新城疫禽流感二联苗，7日龄免疫鸡传染性支气管炎4/91 QX型二联减毒疫苗，前期鸡群发育正常，15日龄个别鸡出现气喘，18日龄鸡群出现咳嗽，关灯后尤为明显，并出现鸡只死亡，严重时死亡率高达18%。对死亡鸡只进行病理学剖检，发现支气管栓塞、气管喉头出血、肺出血水肿发黑、气囊增厚且有干酪物、肝脏肿大、肾脏肿大、输尿管有尿酸盐沉淀、法氏囊肿大[10](图1)。

注：A.支气管栓塞；
B.气管喉头出血;C.肺出血水肿发黑。Note：A.Bronchial embolism;B.Trachea laryngeal hemorrhage;C.Pulmonary edema，bleeding and blackening.图1 病死鸡剖检结果Fig.1 Autopsy results of dead chickens

2.2 细菌分离培养在营养琼脂、麦康凯培养基、SS培养基上，37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，经观察未发现有细菌菌落生长(图2)。

注：A.营养琼脂;B.SS培养基;C.麦康凯培养基。Note：A.Nutrient Agar;B.Salmonella Shigella Agar;C.Maconkey Agar.图2 细菌分离培养结果Fig.2 Results of bacteria isolation and culture

2.3 病毒分离鉴定试验组：接种鸡胚后，前48 h鸡胚发育正常，48 h后鸡胚血管轻微脱落，64 h鸡胚全部死亡。收取尿囊液，经血凝试验发现有血凝现象发生，血凝效价为26。

对照组：接种鸡胚后，鸡胚发育正常，无死亡；
64 h终止孵化，收取尿囊液后经血凝试验未发现有血凝现象发生。

2.4 动物回归试验攻毒前对试验雏鸡进行病理学剖检，未发现明显的病理变化。试验组试验前期雏鸡生长发育正常，14日龄出现鸡只羽毛蓬松、精神萎靡，有呼吸症状；
16日龄死亡3只；
17日龄死亡4只；
18日龄死亡2只，剩余3只鸡未死亡，但发育迟缓，采食量及饮水量下降。

对试验组死亡鸡只进行剖检，发现脾脏肿大出血，胰腺出血，腺胃黏膜易脱落，胃壁增厚、法氏囊肿大、有黏液，肺水肿出血，气管喉头出血，胸腺出血，肾肿大出血，气囊增厚、个别有干酪物。

对试验组未死亡鸡只进行剖检，其中2只鸡法氏囊肿大，另1只鸡组织器官正常；
1只鸡气囊有干酪物，肺出血，肝脏正常，肾脏出血，法氏囊肿大、有黏液，气管出血，肠道血管充血。

对照组鸡只未死亡，发育正常，病理学剖检未发现明显的病理变化。

2.5 分子生物学检测对试验中所有编号样品进行PCR检测，检测结果如图3～6所示。

注：M为 DNA Marker 1 000；
1.病死鸡组织液；
2.试验组鸡胚尿囊液；
3.对照组鸡胚尿囊液；
4.空白组鸡只组织液；
5.试验组口、鼻以及泄殖腔棉拭子；
6.对照组口、鼻以及泄殖腔棉拭子：7.试验组死亡鸡组织液；
8.试验组未死亡鸡组织液；
10.对照组未死亡鸡组织液。Note：M.DNA Marker 100 0;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth，nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth，nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.图3 禽流感病毒PCR检测结果Fig.3 PCR results of avian influenza virus

注：M为DNA Marker 1 000；
1.病死鸡组织液；
2.试验组鸡胚尿囊液；
3.对照组鸡胚尿囊液；
4.空白组鸡组织液；
5.试验组口、鼻以及泄殖腔棉拭子；
6.对照组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;7.试验组死亡鸡组织液；
8.试验组未死亡鸡组织液；
10.对照组未死亡鸡组织液。Note：M.DNA Marker 1 000;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth，nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth，nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.图4 H9亚型禽流感病毒PCR检测结果Fig.4 PCR results of avian influenza H9 subtype virus

注：M为DNA Marker 1 000；
1.病死鸡组织液；
2.试验组鸡胚尿囊液；
3.对照组鸡胚尿囊液；
4.空白组鸡组织液；
5.试验组口、鼻以及泄殖腔棉拭子；
6.对照组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;7.试验组死亡鸡组织液；
8.试验组未死亡鸡组织液；
10.对照组未死亡鸡组织液。Note：M.DNA Marker 1 000;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth，nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth，nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.图5 鸡毒支原体PCR检测结果Fig.5 PCR results of Mycoplasma gallisepticum

注：M为DNA Marker 1 000；
1.病死鸡组织液；
2.试验组鸡胚尿囊液；
3.对照组鸡胚尿囊液；
4.空白组鸡组织液；
5.试验组口、鼻以及泄殖腔棉拭子；
6.对照组口、鼻以及泄殖腔棉拭子;7.试验组死亡鸡组织液；
8.试验组未死亡鸡组织液；
10.对照组未死亡鸡组织液。Note：M.DNA Marker 1 000;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth，nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth，nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.图6 鸡传染性支气管炎病毒PCR检测结果Fig.6 PCR results of avian infectious bronchitis virus

通过将病死鸡病料组织液接种在鸡胚上，可使鸡胚致死，并且有血凝现象发生，说明病料含有毒力较强的血凝性病原；
动物回归试验发现，鸡死亡率达75%，说明病毒致死性强；
通过分子生物学检测确定鸡群发生了鸡传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒混合感染。动物回归试验结果表明，试验组H9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒检测结果呈阳性，说明试验组前期发生了鸡传染性支气管炎和H9亚型禽流感病毒排毒，后期死亡鸡未检出鸡传染性支气管炎病毒，H9亚型禽流感病毒和鸡毒支原体检测结果呈阳性；
未死亡鸡检测出鸡毒支原体；
对照组未检出阳性病原。综上所述，该鸡场前期可能发生鸡毒支原体隐性感染，机体免疫力低下。使用鸡传染性支气管炎4/91 QX型二联减毒疫苗免疫后，随着时间的推移，疫苗毒力累计量增加，进一步损害机体免疫器官，导致继发感染H9亚型禽流感病毒，出现大量鸡只死亡。

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