LncRNA,54770.30在黄鳝(Monopterus,albus)组织及性腺中表达特征分析

夏雪平，连子童，田海峰，李 忠，孙敬锋，胡乔木

(1.天津农学院，天津 300384；
2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223)

黄鳝(Monopterusalbus)，属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)辐鳍亚纲(Actinopterygii)合鳃目(Synbranchiformes)合鳃科(Symbranchidae)黄鳝属(Monopterus)，是我国重要淡水特色养殖鱼类之一。黄鳝因其肉质滑嫩，含有丰富的蛋白质，而且脂肪含量较低，具有较高的药用价值，深受国内外广大消费者喜爱。但是近年来，由于栖息环境的破坏和人类的过度捕捞，野生黄鳝的数量越来越少，为了满足人们对于黄鳝的需要，黄鳝养殖业的发展和黄鳝人工繁殖技术的日渐成熟。黄鳝属于雌雄同体鱼类，具有典型的性逆转现象[1]。由于黄鳝具有性逆转的特点，其生殖性腺发育模式为：雌性发育阶段到间性发育阶段到最终的雄性发育阶段，并且性腺的这一发育过程是单方向进行的不可逆的，即发生性变化后不再由雄性个体逆返为雌性个体[2]，这意味着性成熟的雌性黄鳝个体数量无法维持在一稳定范围内，在一定程度上制约了我国黄鳝养殖业的发展。因此，探究黄鳝性逆转机制不仅具有非常重要的经济意义，还能丰富鱼类性别调控机制[3]。

生物体内存在两种不同的RNA，一种是具备编码蛋白质能力的编码RNA，即信使RNA(message RNA，mRNA)；
一种是不具备编码蛋白质能力的非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)[4]。在ncRNA中，一般认为长度大于200核苷酸称为长链非编码RNA(Long non-codingRNA，LncRNA)。根据LncRNA与蛋白质编码基因的位置关系，可以分为5类，分别是：a．正义；
b．反义；
c．双向；
d．内含子；
e．基因间隔区[5]。LncRNA的作用机制非常众多且复杂，涉及表观遗传学调控、性别分化、细胞内物质运输和染色体重塑，参与细胞分化、生长发育、应激反应和疾病发生发展等多个方面[6]。黑龙江鲟(Acipenserschrencki)精巢与卵巢的LncRNA研究中发现多条LncRNA靶向多个与性腺发育和配子发生相关的基因[8]。在中华鳖(Trionyxsinensis)的精巢与卵巢的LncRNA研究中，发现多条LncRNA靶基因，包括dmrt1、sox9、cyp19a、sox3等与性别分化相关的基因[9]。王伟佳等[7]在大黄鱼(Larimichthyscrocea)性腺中挖掘到了3 984个基因位点的5 162条LncRNA，2 782个LncRNA在精巢与卵巢中差异表达高度相关的LncRNA-mRNA 1 227对，并在精巢中发现了多条与雄性性别决定和性腺发育相关基因的LncRNA，说明大黄鱼的性别决定及性腺发育和分化也受到LncRNA的调控。LncRNA在鱼类性别决定和分化调控中发挥着复杂且重要作用，这也一直是水产动物性别分化研究的热点之一。本研究通过对黄鳝卵巢、间性性腺、精巢的组织进行转录组测序，筛选到一条在黄鳝性腺不同发育时期差异表达的LncRNA 54770.30，通过生物信息学软件分析其生物学特性，比较分析LncRNA 54770.30在不同组织和不同阶段性腺组织表达水平，并定位其在不同阶段性腺的表达位置，探究LncRNA 54770.30与黄鳝性逆转的相关性，以期为揭示LncRNA在黄鳝性逆转机制的作用提供基础数据。

1.1 样品的采集及制备

实验用鱼均采自湖北省仙桃市忠善合作社养殖基地，取不同时期的健康黄鳝共100尾，另取健康的60日龄黄鳝160尾，均充氧分箱暂养于长江水产研究所的活体养殖室内。采集3组不同发育时期黄鳝的性腺、心、肝、脾、肾、脑、胃、肠、肌肉和皮肤等组织，投入液氮中，然后转入-80 ℃冰箱保存用于提取RNA。采集雌性、间性、雄性发育时期黄鳝性腺组织各3组，每组各两份，一份保存于RNA store Reagent中用于RNA提取；
另一份保存于4%的多聚甲醛(pH 7.5)用于制作组织切片，进行后续组织学鉴定及原位杂交实验。

1.2 甲基睾酮刺激处理

将160尾60日龄的黄鳝随机等量分为A、B、C和D 4组，在相同室温环境下分别饲养于容积约为20 L的塑料箱中，每箱注入曝气自来水约6 L，其中A、B和C 3组为实验组，将17α-甲基睾酮(17-Methyltestosterone，MT)用无水乙醇溶解至500、1 000和1 500 μg/L的浓度，早晚向实验组水箱中分别注入不同浓度的MT 400 μL至终浓度分别为100、200和300 μg/L；
D组为对照组注入等量的无水乙醇，每日换水一次，1～2 d喂食等量红虫浆一次。两月后采集性腺样品分别保存于RNA store Reagent与4%多聚甲醛(pH=7.5)中，用于RNA提取、制作石蜡组织切片、HE染色。通过显微镜观察性腺组织形态及细胞结构选取有明显退化的性腺样品，用干提取性腺组织RNA。

1.3 黄鳝总RNA提取与cDNA合成

将样品从-80 ℃冰箱中取出置于预冷的研钵中研磨至粉末状，取约0.1 g的各样品组织于1 mL TRIzol中，使用TRIzol(Invitrogen)法提取各组织中的总RNA。1.5%琼脂凝胶电泳测定RNA完整性，用NanoPhotometer-NP60测定其浓度和纯度。根据PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒(TaKaRa)说明书合成cDNA，存于-20 ℃冰箱中备用。

1.4 荧光定量PCR

根据前期对黄鳝不同发育阶段性腺转录组数据中获得LncRNA 54770.30序列，利用Primer 5软件设计特异性引物(表1)，选EF-1α作内参基因，cDNA作模板，每个组织3个样本，每个反应3个重复。遵照2×T5 Fast qPCR Mix(Vazyme)的使用说明，配成10 μL反应体系。反应在Quant Studio 5实时定量PCR系统上进行，2-△△CT法计算相对表达量；
所得数据在统计软件SPSS 26.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan′s法多重比较分析，当P<0.05差异显著，用*表示；
多重比较中，用不同字母表示差异显著性。

表1 引物信息Tab.1 Primers used in this study

1.5 组织切片原位杂交

以LncRNA54770.30序列设计原位杂交引物(表1)，通过PCR技术对探针片段进行扩增，按胶回收试剂盒(QIAGEN)说明书，对扩增产物进行胶回收，检测DNA片段完整性与浓度，通过T7体外转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)制备探针。选取雌性阶段、间性阶段和雄性阶段黄鳝性腺切片各两组，首先使用二甲苯溶液进行3次时长为5 min的脱蜡反应，然后将切片置于不同浓度的乙醇(100%，100%，95%，70%，50%)依次浸洗5 min；
将脱蜡后的切片置于4% PFA-PBS中固定10 min；
PBS洗涤3次后用0.2 mol/L的HCl处理10 min；
PBST洗涤3次后用10 μg/mL蛋白酶K消化处理。加入预杂交液(含tRNA、肝素)，70 ℃预杂交2～5 h；
加入预杂交液(含反义RNA探针100～200 ng)，70 ℃过夜；
50%预杂交液(无tRNA和肝素)+50% 2×SSC，70 ℃，15 min；
2×SSC，70 ℃，2×30 min；
0.2×SSC，70 ℃，2×30 min；
1×MAB(100 mmol/L马来酸，150 mmol/L NaCl，pH7.5)室温5 min。室温用Blocking Buffer(10%山羊血清，2%BMB，1×MAB)封闭4 h。抗体杂交：加Blocking Buffer 1 000倍稀释的抗体(Roche Applied Science，Germany)，4 ℃过夜，PBST室温冲洗样品。按照BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(Beyotime)说明书进行显色处理；
显色后PBS冲洗终止显色；
4% PFA-PBS固定10 min，PBST洗涤3×5 min；
待切片稍干后用甘油封片，稍后进行拍照。

2.1 LncRNA 54770.30在不同组织的表达分析

通过qRT-PCR对黄鳝LncRNA 54770.30进行不同组织的表达分析，结果显示LncRNA 54770.30在各组织中均有表达(图1)，肌肉中表达量最高，且显著性高于精巢与肝，在其它各组织中表达较低且无显著性差异。

图1 LncRNA 54770.30在不同组织中的相对表达量Fig.1 Relative expression levels of LncRNA 54770.30 in different tissues

2.2 LncRNA 54770.30在不同阶段性腺的表达分析

黄鳝不同阶段性腺的表达结果显示(图2)，LncRNA 54770.30在黄鳝精巢中表达量最高、且显著性高于雌性卵巢与间性性腺，在黄鳝雌性卵巢至间性性腺中表达量呈上升趋势，但无显著性差异。

图2 LncRNA 54770.30在不同发育时期性腺中的相对表达量Fig.2 Relative expression levels of LncRNA 54770.30 in gonads at different developmental stages

2.3 LncRNA 54770.30组织表达定位

通过RNA原位杂交定位LncRNA 54770.30在黄鳝卵巢、间性性腺和精巢中的位置表达。结果显示，反义RNA探针原位杂交的卵巢、间性性腺和精巢组织中均可检测到阳性信号(图3B、C、D)，正义探针均检测不到阳性信号(图3A)。LncRNA 54770.30在卵巢组织中，主要在初级卵母细胞和II期卵母细胞的细胞质和颗粒细胞中均有表达；
在间性性腺中，主要在初级卵母细胞的细胞质、颗粒细胞以及体细胞中表达；
在雄性组织中阳性信号在初级精母细胞及次级精母细胞中表达明显。

图3 LncRNA 54770.30在不同发育时期性腺中的表达定位Fig.3 Localization of LncRNA 54770.30 in gonads at different developmental stages

2.4 MT处理后LncRNA 54770.30性腺中表达模式分析

对60日龄的黄鳝进行MT处理两月后，HE染色切片观察结果显示：MT组大量卵母细胞退化，与对照组相比卵母细胞的滤泡膜与卵母细胞的胞质有明显分离的现象，并伴随着中空小叶出现且生殖脊明显增粗，但未见明显解体的卵巢(图4A)。根据其HE染色切片从MT组选取退化较明显的样品提取RNA合成cDNA并进行qRT-PCR，结果显示(图4B)LncRNA 54770.30在卵巢中表达量降低，且与对照组表达量存在显著差异。

图4 MT处理后LncRNA 54770.30在性腺中的表达Fig.4 Expression of LncRNA 54770.30 in gonad after MT treatment

黄鳝是一种雌雄同体并且雌性先熟的淡水鱼类，不同于其他硬骨鱼类，黄鳝早期发育为雌性，中间经历一个雌雄同体的间性发育时期，后期则发育为雄性，该发育过程是不可逆的。黄鳝的所有个体决定性别的遗传因素是相同的，没有遗传因素上的雌雄之分，因而是一种发育上的而非遗传上的雌雄同体[10]。

LncRNA作为生物中含量较多的非编码RNA，广泛参与了各种生物活动的调控，有研究表明LncRNA参与了生物的性腺发育[11]。本研究通过对黄鳝卵巢、间性性腺、精巢转录组测序中获的差异表达LncRNA 54770.30，通过比较分析LncRNA 54770.30在不同组织和不同阶段性腺组织表达差异，结果显示LncRNA 54770.30在肌肉中显著性高表达(P<0.05)，精巢、肝脏中次之，在胃、肠、脑、心、脾、肾、皮肤中低表达(图1)。对比不同阶段性腺表达结果显示，LncRNA 54770.30在黄鳝雌性卵巢至间性性腺中表达量呈上升趋势，但无显著性差异(P>0.05)，间性性腺至雄性精巢中表达量持续上升且有显著差异(P<0.05)(图2)。可见LncRNA 54770.30在雌性发育时期表达量较低，随着卵母细胞生长到后期的退化，与此同时精原细胞开始增殖、分化，性腺逐渐发育到雄性阶段，LncRNA 54770.30表达量在此程中逐渐上升。在小鼠(Musmusculus)、sox9上游约1.3 kb处存在LncRNA TESCO，通过与转录因子sf1的相互作用维持sox9的表达，从而维持雄性小鼠的发育，在小鼠中还发现了位于5号染色体上的LncRNA DMR通过结合dmrt1的3’UTR抑制dmrt1的表达[12]。在果蝇(Drosophilamelanogaster)中，sxlpe是一个位于果蝇X染色体上的雌性性别决定启动子，可表达R1S、R1A、R2S和R2A四条LncRNAs，其中R2A通过激活sxlpe的转录使果蝇发育为雌性，而R1A、R1S和R2S通过抑制sxlpe使果蝇发育为雄性[13]。RONDEAU等[14]在果蝇精巢中的研究也证明了LncRNA在果蝇精子发育中发挥着不可或缺的功能。王伟佳[15]对大黄鱼性腺LncRNA的研究中筛选得到了61个在卵巢中特异表达的LncRNA，得到了803个在精巢中特异表达的LncRNA，通过对这些LncRNA的预测获得多条可能与精子发生发育相关的LncRNA，这些LncRNA可能发挥着促进性腺向精巢分化或维持精巢正常生理功能的作用；
同时还发现一条与dmrt1呈现强烈正相关性的LncRNA MSTRG.24346，推测其可能在大黄鱼的性别决定中发挥着重要作用。冯博[16]在半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)的研究中，通过高通量测序分析获得精巢特异LncRNA 41个，mRNA 18个；
卵巢特异LncRNA 33个，mRNA 21个；
伪雄鱼精巢特异LncRNA 26个，mRNA 12个，发现LncRNA DMRT2-AS在精巢中表达最高，而在卵巢和肾脏中的表达最低，LncRNA DMRT2-AS的表达在雄鱼的精巢中的表达均表现出持续增加的趋势，这些结果表明LncRNA DMRT2-AS可能对dmrt2的表达具有调控作用。彭锟等[17]在罗非鱼的研究中，通过转录组测序获得了尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)雌、雄性腺中呈现差异表达的LncRNA，并选取LncRNA TCONS-02477925开展研究，结果表明LncRNA TCONS-02477925在罗非鱼卵母细胞发育和性别分化中可能有重要的作用。SONG等[18]在关于鲤鱼(Cyprinuscarpio)的研究中通过对干扰igf3前后的性腺组织进行测序，得到了124个差异表达的LncRNA，这些LncRNA可能在鲤鱼的性别分化和性腺发育中起到重要的作用。目前LncRNA在黄鳝性逆转中的研究报导较为罕有，但参照以上LncRNA在其他鱼类和其他物种中的研究结果，对比分析本研究结果所展示的LncRNA 54770.30在黄鳝的卵巢和精巢中的表达存在十分显著的差异且在精巢中的表达明显高于在卵巢中的表达，可推测LncRNA 54770.30可能在黄鳝的性腺发育和性别分化中起到重要的作用。另外，本研究中黄鳝LncRNA 54770.30在肌肉中显著性高表达(P<0.05)，推测性腺分化与LncRNA 54770.30在肌肉中的高表达有可能存在一定联系。

原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。本研究通过RNA原位杂交来定位LncRNA 54770.30在黄鳝卵巢、间性性腺、精巢细胞中的位置表达(图3)，结果显示在使用反义RNA探针原位杂交的卵巢组织、间性性腺、精巢组织中均可检测到阳性信号(图3B、C、D)，与本研究qPCR结果中显示的LncRNA 54770.30在不同发育时期性腺结中均有表达保持高度一致。LncRNA 54770.30在卵巢组织中主要在初期卵母细胞和II、IV时相期卵母细胞的细胞质和颗粒细胞中表达,V时相期卵母细胞的细胞质中无明显阳性信号；
在间性组织中主要初级卵母细胞的细胞质和颗粒细胞中表达，在性腺外膜中有少量表达，在V时相期卵母细胞的细胞质中无明显阳性信号，阴性对照组中未见阳性信号。何智等[19]对不同发育时期黄鳝性腺中Caspase-3定位分析中也有类似情况，推测可能是因为此时的卵母细胞细胞质中充满了大量卵黄物质和脂质，使细胞质中阳性信号无法观察到。在雄性组织中，阳性信号在初级精母细胞及次级精母细胞中表达明显，在性腺外膜中有少量表达。蒋娇云等[3]的研究中黄鳝的f4基因原位杂交分析结果显示与半定量具有类似的表达情况，即f4基因从IV期卵巢开始表达，一直持续到后期精巢，间期性腺到后期精巢表达量有增高趋势，最终性腺性逆转为精巢。与本研究中LncRNA 54770.30在卵巢至间性性腺和精巢中的表达呈逐渐上升趋势且在精巢中最高具有相同的表达趋势。

17α-甲基睾酮(17-Methyltestosterone，MT)是一种人工合成的白色结晶性粉末状雄性激素，属于固醇类激素，能够干扰动物正常的内分泌系统，促进并维持雄性性器官的发育及第二性征的形成和维持，对雌激素产生拮抗作用，抑制雌性性器官的发育，可做为鱼类性转化诱导剂，常用于苗种培育和性别控制等方面的特效药物据[20]。TANG等[21]报导多种雄激素(甲基睾酮、睾酮和11-酮睾酮)均对成鳝提早性转化无效，但对黄鳝胚胎后期以及仔鳝进行雄激素处理可以促使黄鳝提早性转换。本研究通过在饲养黄鳝的水体和饵料中添加甲基睾酮，对仔鳝进行激素刺激处理，通过对比观察性腺样品的HE切片，MT组大量II期卵母细胞退化，与对照组相比发现卵母细胞的卵膜与卵母细胞的胞质有明显分离的现象，并伴随着中空小叶出现且生殖脊明显增粗，但未见明显解体的卵巢。MT处理后LncRNA54770.30表达相较于对照组明显下降，具有显著性差异(P<0.05)。卓孝磊等[22]在外源性甲基睾丸酮对黄鳝性腺发育的研究中发现MT可促进雌鳝卵母细胞退化，但不能使卵巢完全解体；
MT可促进雌性和间性黄鳝性腺生殖板扩大、延伸并出现中空小叶；
MT对雌雄间体早期的黄鳝的雄性生殖细胞的发育有促进作用。KUO等[23]报道了雌雄同体、雌性先熟的蓝点鮨(Epinephelinaefario)自然生长需要7年才会变为雄鱼，但是用甲基睾酮可诱发2龄鱼提前性转变为雄鱼。方永强等[24,25]最初用17α-甲基睾酮研究对赤点石斑鱼(E.akaara)性逆转的影响，并认为17α-甲基睾酮引起石斑鱼性逆转的作用机制为：17α-甲基睾酮抑制卵母细胞生成卵黄，使卵母细胞出现闭锁，最终退化，并通过刺激生精细胞的增值使精巢增值，激发精子发生机制，最终引起石斑鱼性逆转。综上所述与本实验结果可推测甲基睾酮可能抑制黄鳝卵母细胞积累卵黄，阻止了卵母细胞的进一步发育；
同时也能刺激原始精母细胞的发育而使黄鳝由雌性发育阶段提早进入性逆转阶段，而LncRNA 54770.30在此过程中可能参与黄鳝卵母细胞发育及性逆转过程中的卵母细胞的凋亡和精母细胞的增殖。

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