lncRNA,NEAT1调节miR-15a-5p/HOXD10轴对子痫前期滋养细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

聂桂兰，范徐妃，王春茶，于辉兰，范俊霞

lncRNA NEAT1调节miR-15a-5p/HOXD10轴对子痫前期滋养细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

聂桂兰1，范徐妃2，王春茶1，于辉兰1，范俊霞1

1.金华市妇幼保健院产科，浙江金华 321000；
2.金华市中心医院产科，浙江金华 321000

探讨长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）核富集转录本1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）对子痫前期（preeclampsia，PE）滋养细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及分子机制。体外培养人绒毛膜滋养细胞HTR-8/Svneo，分为正常对照（NC）组、si-NC组、si-NEAT1组、si-NEAT1+anti-NC组和si-NEAT1+anti- miR-15a-5p组。采用四甲基偶氮唑蓝法、流式细胞术和Transwell小室实验检测细胞增殖活性、凋亡和侵袭能力；
实时定量聚合酶链反应检测细胞中NEAT1、miR-15a-5p和同源盒基因D10（homeobox D10，HOXD10）mRNA表达；
蛋白质印迹法检测细胞中HOXD10和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白[钙黏蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和神经钙黏素（N-cadherin）]的表达；
双荧光素酶报告基因和RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）实验验证HTR-8/Svneo细胞中NEAT1、miR-15a-5p和HOXD10的调控机制。敲减NEAT1可显著促进HTR-8/Svneo细胞增殖、侵袭和EMT，抑制细胞凋亡，并上调miR-15a-5p表达，抑制HOXD10的mRNA和蛋白表达（<0.05）；
下调miR-15a-5p的表达可明显逆转NEAT1敲减对滋养细胞增殖、凋亡和侵袭的影响（<0.05）。双荧光素酶和RIP实验证实NEAT1可靶向结合并负调控HTR-8/Svneo细胞中的miR-15a-5p，且HOXD10是miR-15a-5p的靶标。敲减NEAT1可通过上调miR-15a-5p抑制HOXD10表达，进而促进滋养细胞的增殖和侵袭，并抑制滋养细胞的凋亡。

子痫前期；
长链非编码RNA；
核富集转录本1；
微RNA-15a-5p；
同源盒基因D10；
滋养细胞

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种以高血压、蛋白尿为主要特征的妊娠疾病，发生在妊娠20周后，是导致孕产妇和新生儿死亡的主要原因之一[1]。绒毛外滋养细胞异常的细胞侵袭能力是PE发生发展的重要因素[2]，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在PE中发挥重要作用[3-4]，核富集转录本1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）是lncRNA家族的活跃成员。据报道，NEAT1参与调控宫颈癌、乳腺癌和前列腺癌的发生和进展[5-7]。研究显示，NEAT1在PE中上调，并可能通过抑制滋养细胞的增殖、迁移和侵袭促进PE发展[8]。lncRNA可通过充当微RNA（microRNA，miRNA）海绵参与基因调控，微RNA-15a-5p（microRNA- 15a-5p，miR-15a-5p）可抑制子宫内膜癌和肺癌的发展[9-10]。有研究发现miR-15a-5p在PE中下调，上调其表达可诱导滋养细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[11]。生物信息学分析显示，miR-15a-5p为NEAT1的潜在靶点，同源盒基因D10（homeobox D10，HOXD10）mRNA序列含有miR-15a-5p的结合位点。在PE中，HOXD10呈高表达，敲减HOXD10可促进滋养细胞的增殖、侵袭和EMT[12]，表明HOXD10可能是PE中miR-15a-5p的潜在靶标。以上研究提示NEAT1/ miR-15a-5p/HOXD10轴可能调节PE中滋养细胞的增殖、凋亡和侵袭。因此，本研究以人绒毛膜滋养细胞HTR-8/Svneo为研究对象，分析NEAT1/miR- 15a-5p/HOXD10轴与滋养细胞生物学活性的关联及该轴在PE发展中的调控网络。

1.1 主要材料

人绒毛膜滋养细胞系HTR-8/Svneo购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）；
小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）阴性对照（si-NC）和NEAT1 siRNA（si-NEAT1）、miR-15a-5p mimic、miR-15a-5p inhibitor及其阴性对照（miR-NC、inhibitor-NC）购自广州Ribobio公司；
四甲基偶氮唑蓝（methylthiazolyltetrazolium，MTT）细胞增殖/毒性检测试剂盒、膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；
Magna RIP™ RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒购自美国Millipore公司；
兔源一抗HOXD10、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）购自英国Abcam公司；
钙黏蛋白E（E- cadherin）、波形蛋白（vimentin）、神经钙黏素（N- cadherin）购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 将HTR-8/Svneo细胞接种在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中，培养条件：37℃，5% CO2。

1.2.2 细胞转染 将HTR-8/SVneo细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在6孔板上，生长并汇合到60%～70%。使用Lipofectamine™ 3000转染试剂将si-NEAT1、miR-15a-5p inhibitor和si-NC、inhibitor-NC分别转染到HTR-8/SVneo细胞中，实验分为正常对照组（NC组，未转染）、si-NC组（转染si-NC）、si-NEAT1组（转染si-NEAT1）、si-NEAT1+anti-NC组（si-NEAT1与inhibitor-NC共转染）、si-NEAT1+ anti-miR-15a-5p组（si-NEAT1与miR-15a-5p inhibitor共转染）。转染6h，然后在37℃和5% CO2的培养箱中放置48h。随后收集细胞，实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测细胞中NEAT1、miR-15a-5p和HOXD10 mRNA的表达水平，并采用蛋白质印迹法检测细胞中HOXD10蛋白表达，验证转染效果，并继续进行后续实验。

1.2.3 细胞增殖活性检测 转染后，将HTR-8/Svneo细胞以5×103个细胞/孔接种到96孔板中，分别培养24、48和72h。随后，向每孔中加入20μl 5mg/ml的MTT溶液，并在培养箱中培养4h。之后加入150 μl二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），振摇15min。最后，使用酶标仪检测570nm处各孔的光密度（optical density，OD）。

1.2.4 细胞凋亡检测 用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤转染的细胞并离心，向细胞中加入500μl结合缓冲液重悬细胞并将浓度调整为4×105个细胞/ml；
随后加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，将细胞在黑暗中孵育30min。流式细胞仪检测细胞凋亡，激发波长488nm，FITC检测波长530nm，PI检测波长575nm。

1.2.5 细胞侵袭实验 Transwell小室在37℃下用基质凝胶包被30min，将转染48h后的各组HTR-8/ Svneo细胞重悬于无血清培养基中。然后将200µl待测细胞悬液（1×104个细胞）置于上室，将含有10% FBS的600μl培养基放入下室。孵育48h后，取出Transwell小室，PBS冲洗3次，湿棉签小心擦除上室底部膜表面的细胞，侵入膜下表面的细胞用4%多聚甲醛固定并用0.1%结晶紫染色。使用光学显微镜对5个随机选择的视野中的染色细胞进行计数，取平均值。

1.2.6 qRT-PCR 用TRizol试剂提取细胞的总RNA，随后测定RNA浓度和纯度，并通过逆转录试剂盒制备cDNA。在ABI Prism®7500型荧光定量PCR仪上使用SYBR Green Super Mix试剂盒进行qRT-PCR扩增RNA片段，评估NEAT1、miR- 15a-5p和HOXD10 mRNA表达水平。选择GAPDH和U6作为lncRNA、mRNA和miRNA的内参，采用2-ΔΔCt方法计算靶基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.2.7 蛋白质印迹法 收集细胞并使用细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。将蛋白质（30μg）通过10%聚丙烯-酰氨凝胶电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜。室温下用5%脱脂牛奶封闭1h后，将膜与一抗在4°C下孵育过夜。然后与IgG二抗（1∶5000）在室温下孵育1h。使用化学发光试剂显影蛋白质，用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达量。

1.2.8 靶基因预测和双荧光素酶报告基因检测 使用StarBase数据库预测miR-15a-5p与NEAT1和HOXD10之间的结合位点；
构建野生型（WT）和突变型（MUT）重组报告质粒（NEAT1-WT、HOXD10-WT、NEAT1-MUT、HOXD10-MUT）。使用Lipofectamine™ 3000转染试剂将NEAT1-WT、NEAT1-MUT或HOXD10-WT、HOXD10-MUT与miR-NC或miR-15a-5p mimic共转染至HTR-8/Svneo细胞；
HTR-8/Svneo细胞（2×105个细胞/孔）在6孔板中培养并在达到60%～70%融合时转染，转染48h后，收获并裂解细胞，使用双荧光素酶报告分析系统进行荧光素酶测定，并将萤火虫荧光素酶活性值标准化为海肾荧光素酶活性值。

1.2.9 RNA结合蛋白免疫沉淀测定 使用Magna RIP™ RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）试剂盒验证NEAT1与miR-15a-5p的结合。具体步骤：HTR-8/Svneo细胞在RIP裂解液中裂解。然后将包含Argonaute-2（Ago2）抗体或IgG抗体（作为阴性对照）的磁珠与细胞裂解物在4°C下孵育6h，提取免疫沉淀RNA，进行qRT-PCR分析NEAT1与miR-15a-5p的富集。

1.3 统计学方法

2.1 敲减NEAT1对HTR-8/Svneo细胞增殖的影响

在48h和72h时，si-NEAT1组的OD值较NC组、si-NC组显著降低（<0.05）；
si-NEAT1+anti-miR- 15a-5p组的OD值较si-NEAT1组、si-NEAT1+anti-NC组显著升高（<0.05），见表2。

2.2 敲减NEAT1对HTR-8/Svneo细胞凋亡和侵袭的影响

si-NEAT1组HTR-8/ Svneo细胞凋亡率较NC组、si-NC组显著降低，侵袭细胞数显著增加（<0.05）；
si-NEAT1+anti-miR-15a-5p组HTR-8/Svneo细胞凋亡率较si-NEAT1组、si-NEAT1+anti-NC组显著升高，侵袭细胞数显著减少（<0.05），见表3。

2.3 敲减NEAT1对HTR-8/Svneo细胞中NEAT1、miR-15a-5p、HOXD10表达水平的影响

与NC组、si-NC组相比，si-NEAT1组HTR-8/ Svneo细胞中NEAT1、HOXD10 mRNA和HOXD10蛋白表达水平显著降低，miR-15a-5p表达水平显著升高（<0.05）；
与si-NEAT1组、si-NEAT1+anti-NC组相比，si-NEAT1+anti-miR-15a-5p组HTR-8/ Svneo细胞中HOXD10 mRNA和蛋白表达水平显著升高，miR-15a-5p表达水平显著降低（<0.05），见表4。

表1 引物序列

表2 各组HTR-8/Svneo细胞OD值比较（）

注：与NC组比较，*<0.05；
与si-NC组比较，#<0.05；
与si-NEAT1组比较，△<0.05；
与si-NEAT1+anti-NC组比较，▲<0.05

表3 各组HTR-8/Svneo细胞凋亡率和侵袭细胞数量比较（）

注：与NC组比较，*<0.05；
与si-NC组比较，#<0.05；
与si-NEAT1组比较，△<0.05；
与si-NEAT1+anti-NC组比较，▲<0.05

2.4 敲减NEAT1对HTR-8/Svneo细胞中EMT相关蛋白表达的影响

与NC组、si-NC组相比，si-NEAT1组E-cadherin蛋白水平显著降低，N-cadherin、vimentin蛋白水平显著升高（<0.05）；
与si-NEAT1组、si-NEAT1+anti- NC组相比，si-NEAT1+anti-miR-15a-5p组E-cadherin蛋白水平显著升高，N-cadherin、vimentin蛋白水平显著降低（<0.05），见表5。

2.5 NEAT1在HTR-8/Svneo细胞中靶向并负调控miR-15a-5p

通过StarBase数据库预测，miR-15a-5p被确定为NEAT1的潜在靶标，见图1。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与NEAT1-WT+miR-NC组相比，NEAT1-WT+miR-15a-5p mimic组细胞的荧光素酶活性显著降低[（1.02±0.11）（0.35±0.06），<0.05]，与NEAT1-MUT+miR-NC组相比，NEAT1-MUT+miR- 15a-5p mimic组细胞的荧光素酶活性无显著变化[（0.99±0.10）（1.01±0.09），>0.05]。RIP检测结果显示，相对于IgG对照组，NEAT1和miR-15a-5p在Ago2复合物中高度富集，见表6。

2.6 miR-15a-5p负调控HOXD10的表达

使用StarBase数据库预测miR-15a-5p的靶基因，发现HOXD10的3"UTR具有与miR-15a-5p互补的序列，见图2。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与HOXD10-WT+miR-NC组相比，HOXD10-WT+miR- 15a-5p mimic组细胞的荧光素酶活性显著降低[（1.00±0.11）（0.40±0.06），<0.05]，与HOXD10- MUT+miR-NC组相比，HOXD10-MUT+miR-15a-5p mimic组细胞的荧光素酶活性无显著变化[（0.98± 0.09）（1.02±0.10），>0.05]。

表4 各组HTR-8/Svneo细胞中NEAT1、miR-15a-5p和HOXD10表达水平比较（）

注：与NC组比较，*<0.05；
与si-NC组比较，#<0.05；
与si-NEAT1组比较，△<0.05；
与si-NEAT1+anti-NC组比较，▲<0.05

表5 各组HTR-8/Svneo细胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白水平比较（）

注：与NC组比较，*<0.05；
与si-NC组比较，#<0.05；
与si-NEAT1组比较，△<0.05；
与si-NEAT1+anti-NC组比较，▲<0.05

图1 StarBase数据库预测的NEAT1和miR-15a-5p的靶向结合序列

表6 RIP检测结果（）

注：与IgG对照组比较，*<0.05

图2 StarBase数据库预测的HOXD10和miR-15a-5p的靶向结合序列

绒毛膜滋养细胞浸润到子宫壁的肌肉层是胎盘发育不可缺少的生理过程。研究表明，PE患者的滋养细胞迁移和侵袭能力明显下降，导致螺旋动脉重塑不足，这是PE发病的主要驱动因素[13]。lncRNA的异常表达可通过调节细胞过程（如迁移、侵袭）促进PE的发生和进展。

在PE患者胎盘组织中NEAT1表达水平升高[14]；
敲减NEAT1表达可促进PE大鼠胎盘滋养细胞的增殖、迁移和侵袭[8]。本研究发现，敲减NEAT1可抑制滋养细胞凋亡，同时增加细胞活力和侵袭能力。EMT是细胞迁移和侵袭所必需的，其特点是低表达的上皮标志物（E-cadherin）和高表达的间充质标志物（N-cadherin和vimentin）[15]。在本研究中，敲减NEAT1可降低E-cadherin表达，升高vimentin和N-cadherin表达，促进滋养细胞的EMT过程。综合以上结果可知，通过诱导EMT过程，敲减NEAT1可促进滋养细胞增殖和侵袭，并抑制细胞凋亡。这与既往研究结果一致，表明沉默NEAT1可能有助于缓解PE进展。

lncRNA发挥其生物学功能的途径主要是通过结合miRNA以调节下游靶基因。已发现miR-15a-5p在PE中下调[11]，过表达miR-15a-5p可诱导滋养细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。本研究通过生物信息学预测网站发现miR-15a-5p与NEAT1具有互补的结合位点。在HTR-8/Svneo细胞中敲减NEAT1后，miR-15a-5p的表达增加。随后，双荧光素酶报告实验证实miR-15a-5p是NEAT1的靶基因；
RIP检测结果进一步证实NEAT1和miR-15a-5p可在HTR-8/ Svneo细胞中结合。此外，进一步发现下调miR-15a- 5p逆转NEAT1敲减对滋养细胞增殖、凋亡和侵袭的影响，表明NEAT1可靶向负调控HTR-8/Svneo细胞中的miR-15a-5p。提示NEAT1可能通过与miR- 15a-5p竞争性结合促进PE发展。

HOXD10在调控细胞增殖、凋亡、分化、血管生成及肿瘤细胞侵袭转移等方面发挥重要作用[16]。HOXD10的表达水平和功能因癌症类型而异，例如在胶质瘤中HOXD10表达增加[17]，而在子宫内膜癌中HOXD10表达减少[18]。Zhang等[12]研究显示，HOXD10在PE胎盘中呈高表达，敲减其表达可促进滋养细胞的增殖、侵袭和EMT。本研究使用生物信息学网站预测到miR-15a-5p和HOXD10之间存在结合位点，表明HOXD10是miR-15a-5p的潜在靶标。双荧光素酶报告实验进一步证实HOXD10是miR- 15a-5p的靶基因。此外，qRT-PCR证实这一发现，NEAT1敲减可正向调节HOXD10表达，而miR- 15a-5p抑制挽救NEAT1敲减诱导的HOXD10表达减少。提示miR-15a-5p可通过靶向HOXD10抑制细胞凋亡，并促进滋养细胞的增殖和侵袭。

综上所述，敲减NEAT1可促进滋养细胞增殖和侵袭，并抑制细胞凋亡，其作用机制可能与调节miR-15a-5p/HOXD10轴有关。本研究表明NEAT1是治疗PE的潜在靶点，可为PE发病机制的研究提供有效的理论依据。但lncRNA的功能非常复杂，仍需要进一步的体内实验和机制探索，以深入揭示PE的发病机制。

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Influences of lncRNA NEAT1 on the proliferation, apoptosis and invasion of preeclamptic trophoblast cells by regulating the miR-15a-5p/HOXD10 axis

NIE Guilan, FAN Xufei, WANG Chuncha, YU Huilan, FAN Junxia

1.Department of Obstetrics, Jinhua Maternal & Child Health Care Hospital, Jinhua 321000, Zhejiang, China; 2.Department of Obstetrics, Jinhua Municipal Central Hospital, Jinhua 321000, Zhejiang, China

To investigate the influences and molecular mechanism of long noncoding RNA (lncRNA) nuclear-enriched abundant transcript 1 (NEAT1) on the proliferation, apoptosis and invasion of preeclampsia (PE) trophoblast cells.Human chorionic trophoblast cells HTR-8/Svneo were cultured in vitro and grouped into normal control (NC) group, si-NC group, si-NEAT1 group, si-NEAT1+anti-NC group, and si-NEAT1+anti-miR-15a-5p group. Cell proliferation activity, apoptosis and invasion ability were detected by methylthiazolyltetrazolium (MTT) method, flow cytometry and Transwell chamber assay; quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of NEAT1, miR-15a-5p and homeobox D10 (HOXD10) mRNA in cells; Western blotting was used to detect the expression of HOXD10 and epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related proteins (E-cadherin, vimentin and N-cadherin) in cells; the regulatory mechanism of NEAT1, miR-15a-5p and HOXD10 in HTR-8/Svneo cells was verified by dual-luciferase reporter gene and RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) experiments.Knockdown of NEAT1 greatly promoted the proliferation, invasion and EMT of HTR-8/Svneo cells, inhibited cell apoptosis, up-regulated the expression of miR-15a-5p, and inhibited the expression of HOXD10 mRNA and protein (<0.05); down-regulation of miR-15a-5p expression greatly reversed the influences of NEAT1 knockdown on the proliferation, apoptosis and invasion of trophoblast cells (<0.05). Dual-luciferase and RIP experiments confirmed that NEAT1 could target and negatively regulate miR-15a-5p in HTR-8/Svneo cells, and HOXD10 was a target of miR-15a-5p.Knockdown of NEAT1 may inhibit the expression of HOXD10 by up-regulating miR-15a-5p, thereby promoting the proliferation and invasion of trophoblast cells, and inhibiting the apoptosis of trophoblast cells.

Preeclampsia; Long noncoding RNA; Nuclear-enriched transcript 1; MicroRNA-15a-5p; Homeobox D10; Trophoblast cell

R714.25

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.07.003

浙江省基础公益研究计划项目（LQ19H040002）

范徐妃，电子信箱：fanx0_08@163.com

（2022–09–07）

（2023–01–31）

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